基于液相色谱-质谱技术的CYP450酶亚型绝对定量方法研究

哺乳动物的I相药物代谢酶-CYP450，能够对大多数药物进行生物转化；而药物对P450 也有着诱导作用。因此，及早阐明药物对P450表达量的影响对于评价人体用药安全性和有效性是十分重要的。.以往在考察药物对酶的诱导或抑制时，仅根据P450酶总量或某几个易于定量亚型的变化，并不能准确地反映出药物对体内P450各亚型的真实诱导或抑制情况。因此，建立一种普适的P450亚型定量分析方法非常重要。.由于P450不同亚型经蛋白酶解之后可以产生其对应的特异性肽段，本课题拟结合液相色谱的高效分离性能和质谱多反应监测（MRM）的高通量、高灵敏度检测性能，通过特征肽段实现对P450亚型的绝对定量，特色之处在于设计具有酶切位点的同位素标签，从而可以消除实验操作过程中的误差，实现更精确的蛋白绝对定量。这对于揭示某些P450亚型的未知功能和底物特异性、指导新药设计及临床安全合理用药有着重要的科学意义。

采用基于蛋白质组学的手段建立了药物代谢酶不同亚型的绝对定量方法。首先，以大鼠的药物代谢酶（P450和UGT）为研究对象，通过分析大鼠药物代谢酶的氨基酸序列，找出能代表各药物代谢酶亚型的特征肽段序列，合成非同位素标记的特征肽段，利用LC-MS/MS技术，采用多反应监测（Multiple reaction monitoring，MRM）模式，建立非同位素标记肽段标准曲线，实现对大鼠肝微粒体样本中P450和UGT的直接绝对定量；然后合成同位素标记肽段，考察复杂基质对定量结果的影响，并初步对比以同位素标记肽段作为内标进行绝对定量和以非标肽段建立标准曲线进行绝对定量的差异。以人的药物代谢酶为研究对象，建立以同位素标记肽段作为内标的绝对定量方法，测定人肝微粒体样本中7种最重要的P450亚型的含量，并将所得数据与探针底物法所得P450 酶活性数据进行相关性分析，从而评价所建立绝对定量方法的准确性。通过本研究，建立针对大鼠和人的部分药物代谢酶的绝对定量方法，为药物代谢酶的定量研究提供依据，进一步为药物开发、药物设计、药物-药物相互作用以及临床个体化用药研究提供新方法、新思路。