环境变应原活化蛋白酶激活受体2通路介导肥大细胞脱颗粒：慢性瘙痒新靶点的研究

Pruritus is the main symptom of allergic skin diseases. The environmental allergen (dust mite) is the important causative factor which can cause pruritic skin diseases such as atopic dermatitis etc. Mast cell plays an important role in the pathogenesis of pruritus. Recent researches show that the activation of PAR2 pathway and the mast cells degranulation are closely related to the chronic pruritus. This in vitro and animal model study focus on the effect of dust mite allergen Derp1 on the activation of PAR2, mast cells degranulation and tryptases release, scratching behavior of AD mice and the expression level of tryptases in mice skin lesion. Moreover, to prove the effect of the PAR2 pathway activation on the mast cells degranulation and the pathogenesis of chronic pruritus by the blockade of PAR2. The purpose of this study is to clarify the environmental allergen can be involved in the pathogenesis of chronic pruritus by the “activation of PAR2 －mast cells degranulation-－up-regulation of tryptases”pathway. Through the research, to reveal a new target of the pathogenesis of chronic pruritus and to provide theoretical basis for blocking pruritus.

瘙痒是过敏性皮肤病的主要症状，环境变应原如屋尘螨是引起特应性皮炎等瘙痒性皮肤病的重要诱发因素，肥大细胞是参与瘙痒发生的关键细胞。新近发现蛋白酶激活受体2（PAR2）通路的活化与肥大细胞脱颗粒和慢性瘙痒的发生可能密切相关。本课题从体外实验和动物模型入手，重点研究屋尘螨变应原Derp1对肥大细胞表面PAR-2的活化作用、对肥大细胞脱颗粒释放类胰蛋白酶的影响、对特应性皮炎小鼠搔抓行为的影响和皮损局部类胰蛋白酶表达水平的影响，并通过阻断PAR2，证实PAR2通路的活化在肥大细胞脱颗粒和慢性瘙痒发生中的作用。本课题旨在阐明环境变应原可以通过“PAR2活化－肥大细胞脱颗粒－类胰蛋白酶表达上调”这一通路参与慢性瘙痒的发生，从而明确慢性瘙痒发生的新靶点，为阻断瘙痒的发生提供理论依据。

目的：明确“屋尘螨变应原-PAR2通路-肥大细胞脱颗粒-类胰蛋白酶”这一途径与慢性瘙痒发生的关系。.方法：通过流式细胞术、DNA电泳检测人肥大细胞系HMC-1、小鼠骨髓及腹腔来源肥大细胞（BMMC及PMC）表面PAR2受体的表达；用ELISA测定，Derp1、PAR2拮抗剂FSLLRY+Derp1刺激HMC-1后，类胰蛋白酶表达的变化；用分光光度法检测，Derp1、FSLLRY+Derp1、类胰蛋白酶刺激BMMC及PMC后，β-己糖胺酶表达的变化；钙成像技术测定，Derp1、类胰蛋白酶、FSLLRY+Derp1、FSLLRY+类胰蛋白酶刺激后HMC-1细胞内Ca2+浓度的变化。观察屋尘螨变应原诱导的特应性皮炎（AD）小鼠搔抓行为的变化；免疫荧光及q-PCR检测AD小鼠皮损处PAR2受体和类胰蛋白酶的表达；q-PCR检测，AD小鼠皮损处炎症和瘙痒相关因子、受体的mRNA表达。.结果: Derp1可激活HMC-1释放类胰蛋白酶，其水平显著高于对照组(P＜0.05)，该效应可被FSLLRY阻断(P＜0.05)。Derp1、类胰蛋白酶均可引起HMC-1细胞内Ca2+浓度显著增加(P＜0.05)，且均可被FSLLRY阻断(P＜0.05)。BMMC及PMC均不表达PAR2。Derp1、类胰蛋白酶刺激后，BMMC和PMC释放β-己糖胺酶的水平无明显改变(P＞0.05)。模型组小鼠搔抓行为较对照组小鼠明显增加(P＜0.05)。与对照组相比，建模组皮损处PAR2 mRNA及蛋白表达均显著增加，类胰蛋白酶蛋白表达增加，而mRNA表达无明显改变。与对照组相比，模型组皮损局部IL-4，IFN-γ，IL-31，IL-33，CCL17和CCL22 mRNA表达明显增高（P＜0.05），Mrgprb2，IL-13，TSLP mRNA表达无明显变化（P＞0.05），Mrgprc11，CTSS mRNA表达明显降低（P＜0.05）。.结论:（1）Derp1可通过激活PAR2引起HMC-1脱颗粒并释放类胰蛋白酶，后者亦可活化HMC-1表面的PAR2从而形成正反馈,与BMMC和PMC相比具有种属差异性。（2）AD小鼠搔抓行为明显增加且皮损内的PAR2及类胰蛋白酶及炎症因子、受体表达明显增加，提示“Derp1-PAR2活化-肥大细胞脱颗粒-释放类胰蛋白酶”通路与慢性瘙痒有密切联系，但需进一步验证其相关性。