结核分枝杆菌丝氨酸乙酰基转移酶(SAT)的结构与功能研究

半胱氨酸生物合成途径在细菌和人体中有一定差异，催化丝氨酸与乙酰CoA转变为O-乙酰丝氨酸的丝氨酸乙酰基转移酶(SAT)为细菌特有，而不存在于人体中。我们的前期研究结果显示，结核分枝杆菌cysE基因(Rv2335)编码的CysE蛋白具有丝氨酸乙酰基转移酶活性。本课题的研究目标和内容包括：1.优化结核分枝杆菌cysE基因的表达条件以获得大量的可溶性CysE蛋白，进而研究其酶促反应动力学特点；2.对结核分枝杆菌 cysE 基因进行定点突变，确定丝氨酸乙酰基转移酶的活性部位；3.以耻垢分枝杆菌为模式菌构建cysE基因敲除菌株MS?cysE，确定CysE为抗结核新药作用靶点；通过对MS?cysE菌株的蛋白质组学分析，以期发现更多的靶点。本课题的研究成果将对高通量筛选酶抑制剂、测定酶的晶体结构及定向设计抑制剂提供依据和保障。

丝氨酸乙酰基转移酶 (serine acetyltransferase, SAT/CysE) 参与L-半胱氨酸( L-cys) 的合成，进而参与体内重要含硫化合物的代谢，因此，丝氨酸乙酰基转移酶在分枝杆菌能量代谢和物质代谢中发挥重要作用。因此，丝氨酸乙酰基转移酶可能是抗结核药物的一个潜在的设计靶点。.为探索丝氨酸乙酰基转移酶的结构与催化活性的关系以及与分枝杆菌生长的必要性。本课题首先体外表达和纯化了结核分枝杆菌丝氨酸乙酰基转移酶，并获得了大量的可溶性M. tuberculosis cysE蛋白，进而对丝氨酸乙酰基转移酶的酶促反应特性进行检测，利用DTNB法和HPLC检测到体外纯化蛋白的丝氨酸乙酰基转移酶活性。进一步利用DTNB法得到最适温度为37C，最适pH值为pH 7.5，Vmax为0.0073mM/min, KacCoA为0.0513 mM。.利用生物信息学方法预测M. tuberculosis CysE的可能活性位点，用PCR技术定点突变氨基酸的密码子，表达出突变的M. tuberculosis CysE蛋白，测定其丝氨酸乙酰基转移酶活性，筛选可能的与丝氨酸乙酰基转移酶活性相关位点。研究结果表明D67-A，H82-A， H117-A这三个氨基酸位点是酶活性相关的必须氨基酸。 .采用同源DNA重组技术获得M. smegmatis cysE基因敲除菌株Sm-ΔM_5947。探讨MSMEG_5947基因对耻垢分枝杆菌的生长及代谢的影响，以确定它的抗结核药物靶点的相关性。研究结果表明：耻垢分枝杆菌MSMEG_5947基因为结核分枝杆菌乙酰基转移酶的同源基因，生长曲线结果可知该基因为耻垢分枝杆菌生长非必需的基因，该基因有效失活后，细菌生长曲线未见显著抑制效应。MSMEG_5947基因敲除菌株（Sm-ΔM_5947）的蛋白组学研究表明：MSMEG_5947基因敲除后，2-磷酸甘油酸脱水酶，触发因子，腺苷三磷酸酶在Sm-ΔM_5947菌株中表达呈上调趋势，二氢硫辛酰胺脱氢酶在Sm-ΔM_5947菌株表达呈下调趋势。电镜分析结果表明：Sm-ΔM_5947菌株细菌细胞壁呈现粗糙表型。因此，cysE基因功能缺失后，耻垢分枝杆菌出现细胞壁结构的变化和能量代谢相关蛋白表达差异。