马槟榔“甜水效应”的分子机制研究

Mabinglang is the only plant in China that contains a sweet protein. Its kernel first tastes a little bitter; then it has a strong, long sweet after taste. Once the sweet after taste disappears, then, by drinking water, the water itself is experienced as intensely sweet. Sweet"water-taste"are gustatory after-impressions elicited by water following the removal of a chemical solution from the mouth. Mabinlin is sweet, but mabinlin itself can not explain sweet "water-taste". In this project, we plan to separate the proteins and small molecules, using high-throughput screening technologies and classical discovery approaches to identify the flavor ingredients. We plan to uncover the reasons for the bitterness, sweetness and sweet "water-taste". This study will help us understand more about the structure and function of the human sweet taste receptor and the way it interacts with its various agonists. Especially for the use of modern separation technology and biological technology as an organic union, fast search for novel natural sweeteners or new natural sweetness modulators.

马槟榔是我国特有的含甜蛋白的野生果树资源，其种仁嚼之先略有苦涩味，稍后即有持久性甜感, 喝水再次产生甜蜜感。"甜水效应"是甜味受体受到激动剂作用的一种后觉反应。已证明的甜味物质是马槟榔甜蛋白（Mabinlin），但是马槟榔的甜水效应无法用Mabinlin解释，有效成分不清楚。本项目拟分离鉴定马槟榔种子中的小分子化合物，并通过甜味受体T1R细胞系的荧光成像筛选，定点突变，寻找马槟榔"甜水效应"的有效成分，从分子水平上论证活性成分调节甜味受体的作用位点和作用方式。阐明马槟榔苦味、甜味和"甜水效应"味觉的分子机制，在此基础上探讨小分子化合物和大分子甜蛋白受体之间协同作用的分子机理。本课题将有助于新型甜味剂或者调节剂的分子机理研究，对开发利用马槟榔资源，以及以其活性成分为模板设计新型甜味剂，特别是对于利用现代分离技术与生物技术的有机结合，快速寻找新型天然甜味剂或者新型天然甜味调节剂具有特殊意义。

项目以我国特有的含甜蛋白的野生果树资源马槟榔为研究对象，研究其种仁嚼之先略有苦涩味，稍后即有持久性甜感, 喝水再次产生甜蜜感的“甜水效应”，这是甜味受体受到激动剂作用的一种后觉反应。. 主要内容为1）马槟榔大分子甜蛋白的分离：马槟榔总蛋白的提取，初步的分离纯化，经过感官测试实验，有甜味，但是没有“甜水效应”。2）马槟榔小分子化合物的分离鉴定：从马槟榔种壳中分离分离鉴定了20 个化合物；从马槟榔种皮中分离分离鉴定了16个化合物；从马槟榔种仁中分离分离鉴定了 16个化合物。3）甜味受体(T1R2-T1R3) 稳定细胞株的建立：通过基因构建质粒 pEAK10-T1R2和pCDNA3.1-ZEO-T1R3转染稳定表达Gα15蛋白的人胚肾细胞(HEK-293)，扩大培养，并通过钙敏感荧光成像评估其对甜味刺激的反应。 4）T1R活性筛选：通过已建立的甜味受体(T1R2-T1R3) 稳定细胞株筛选已分离到的小分子化合物， 确定具有“甜水效应”的小分子有效成分， 结果发现有3个化合物为活性成分。. 通过对马槟榔中大分子和小分子成分进行化学成分的分离鉴定，结合感官实验和甜味受体T1R细胞系的荧光成像筛选，研究结果证明产生甜味的物质基础是大分子马槟榔甜蛋白，产生“甜水效应”的物质基础是小分子物质。本项目的研究结果为研究小分子化合物和大分子甜蛋白受体之间协同作用的分子机理，进一步开发新型甜味剂或者调节剂提供了重要的前期数据和理论支持。. 除了以上工作外，我们还对另外一个甜味资源植物多穗柯甜叶茶进行了化学成分分离鉴定和甜味活性筛选的工作，3个黄酮类化合物具有甜味活性。这一工作对于利用现代分离技术与生物技术的有机结合，通过稳定的甜味受体细胞株高通量地快速寻找新型天然甜味剂或者新型天然甜味调节剂具有特殊意义。. 截止至目前，已发表与项目相关的论文10篇，申请国家发明专利5项，培养硕士研究生13名，其中毕业6名；另有大量实验数据和论文还在整理撰写。