碳纳米管的免疫效应及分子机制研究

Nano-materials have abundant potential applications in many fields due to their excellent physical and chemical properties. However, some preliminary studies showed that many nano-scale materials had potential toxic effects, so it is very necessary to evaluate the biological effects and toxicity mechanisms of nano-materials at the cellular and molecular level. Carbon nanotubes(CNTs) have attracted great interest due to their excellent properties of mechanical strength, electrical conductivity, chemical stability, and their ability to be functionalized with other molecules. The application of CNTs has been extended to electronic devices, drug delivery and biosensors. With increasing industrial productions of carbon nanotubes, public concern on their health effects is growing rapidly. However, the toxicity and biocompatibility of CNTs have not been thoroughly investigated, many results are even contradictory. Recently our results demonstrated that MWCNT-COOH was less cytotoxic as compared to MWCNT which demonstrated to be similarly cytotoxic with MWCNT-OH. Since immune cells play an important role in mediating the immune responses to foreign substances and collectively protecting the body. This study was performed to investigate the immune toxicity of single/multi-walled CNTs with different diameters, length and modifications, and explore the relevant molecular mechanism for scientifically developing more applications of CNTs.

随着碳纳米管(CNTs)在各领域的用途越来越多的被开发，其生物安全性问题已成为大规模应用的瓶颈之一。目前有关碳纳米管的安全性研究尚处于初级阶段，相关研究主要局限在肺和巨噬细胞对碳纳米管的反应，并且由于各研究采用的碳纳米管的性质不同，导致研究的结果也不尽相同，致使至今对于CNTs是否具有安全问题仍存在一定争议。近期我们对多壁碳纳米管、羧基化多壁碳纳米管及羟基化多壁碳纳米管三种碳纳米管的安全性进行了初步评价，发现不同修饰的碳纳米管的细胞毒性有一定差别，其影响机制也有所不同。在此基础之上，本课题拟选择多种不同尺寸及不同修饰的单/多壁碳纳米管作为研究对象，从整体、细胞和分子三个层次上对CNTs的免疫效应及分子机制进行研究，了解不同性质的CNTs的作用规律，以更加科学客观地挖掘CNTs的应用价值，保障相关基础研究及应用的健康发展。

碳纳米管（CNT）由于其独特的空间结构和优良的电热理化性使得碳纳米管在电子器件、复合材料及生物医药等众多领域有着广泛的应用前景。目前有关碳纳米管研究主要着重于其应用方面，其安全性研究尚处于初级阶段，多数研究主要局限于肺和巨噬细胞对碳纳米管的反应方面，并且各研究采用的碳纳米管各式各样，彼此之间存在很大的差异，评价标准也不统一，得出的研究结果不尽相同，甚至有些结果完全相反，因此碳纳米管的安全性问题有待进一步系统深入的研究。本研究探索不同直径、长度、修饰的CNT在统一的研究条件下对免疫系统的影响。将所研究的21种CNT分成7组，每组有3种CNT，它们有相同的直径、长度，但是有不同的修饰，包括(P-CNT)、(CNT-OH)、(CNT-COOH)。体外实验是将人外周血单个核细胞PBMCs与21种CNT浓度分别以25、50、100、200μg/ml的浓度混合培养，然后分别在12h，24h、48h、72h时，通过检测LDH的漏出率观察细胞膜的破坏程度；通过检测细胞内ROS的含量观察孵育后的细胞内的氧化压力；并通过检测培养上清液中细胞因子的浓度观察免疫炎症情况。体内动物实验中，利用非暴露式气管滴注法向每只小鼠肺内注入40μl，浓度为0.5mg/ml或5mg/ml的碳纳米管溶液。然后通过ELISA方法测定实验动物第1，3，7天的血清中的非特异性免疫细胞因子、第7天左肺泡灌洗液和右肺组织匀浆上清液中的氧化、纤维化及炎症因子SOD、MDA，HYP、TGF-β、PDGF及IL-1β、TNF-α、IL-6，以观察各碳纳米管引起炎症反应的变化及变化规律。结果表明，碳纳米管的类型、直径、长度及修饰对体内外的免疫安全性均有影响，不同的碳纳米管引起免疫反应情况及变化趋势也不完全相同，并且同一碳纳米管对在体内外的影响不一致。碳纳米管的类型（单壁或多壁）、直径、长度、及化学修饰均是重要的安全性评价的重要参数。 .另外本课题还研究了TAT/壳聚糖修饰MWNTs作为siRNA递送载体的体内外研究，结果显示利用具有强穿膜效应的TAT多肽对低分子量壳聚糖进行修饰后，将其作为多壁碳纳米管的分散剂，可以显著提高碳纳米管的分散性及细胞摄入率，降低碳纳米管的细胞毒性。体内实验证实该功能化的碳纳米管主要聚集于肿瘤部位及肝脏，并最终通过泌尿系统排出体外，这些发现对于将碳纳米管作为基因载体的研究具有重要意义。