黄顶菊中除草活性成份的构效关系与作用机制研究

为了从天然产物中发现新的先导化合物和新的作用靶标，本项目在明确外来入侵植物黄顶菊中高除草活性成份的结构及初步作用机制的基础上，开展构效关系与作用机制的深入研究。对活性成份进行分子设计、衍生合成和分子搜寻及除草活性测定，利用SYBYL软件建立构效关系模型，预测除草活性基团的结构；以马唐等为试材，测定活性成份对叶绿体超微结构的影响及对电子传递、光合磷酸化和碳同化的影响以明确其光合作用位点；在此基础上，利用拟南芥T-DNA插入突变体库，筛选对活性成份不敏感的突变体，同时利用基因芯片技术和蛋白质双向电泳、质谱技术，获得候选靶标基因/蛋白，通过构建基因功能缺失和功能获得突变体来验证候选靶标基因/蛋白，利用构效关系模型，阐明黄顶菊中除草活性成份的作用机制。本研究结果，不仅为阐明黄顶菊的入侵机制提供理论依据，而且也为除草剂的创制提供新的先导，同时对外来入侵植物的利用研究提供可行的思路。

本项目通过对外来入侵植物黄顶菊中得到的异香豆素类活性成分进行分子改造设计和衍生合成，得到30余种与其骨架相同的的异香豆素化合物，并对所获得的化合物进行了系统的除草生物活性测定，得到6个活性良好的化合物。通过活性测定数据与化合物的化学结构进行构效关系的研究，结果发现将苯环或吡啶环引入到异香豆素母体结构中，或者引入含氯基团、甲基、甲氧基都可有效提高除草活性。本研究对该类化合物的进一步研究及结构修饰提供了一定的方向。选择活性最好的化合物3-己基-4-（3-氯苯基）-6,7-二甲氧基异香豆素进行转录组测序，分析结果表明在发现的差异蛋白中，细胞色素P450基因AT4G27710最有可能为致死基因，可作为候选基因进行更深入的分析。 .本项目利用色谱法对黄顶菊中的除草活性成分进行了提取分离，得到了纯度较高的活性小分子，经结构鉴定为α-三联噻吩。利用生理生化技术对α-三联噻吩的除草作用机制进行了初步研究，结果发现其可能的作用方式是抑制了植物的光合作用。为进一步确定其作用靶标，采用双向电泳技术进行蛋白质组学分析，得出差异最显著的蛋白，并确定其为转酮醇酶。以玉米转酮醇酶1ITZ的晶体结构为模板，采用同源建模的方法模拟了拟南芥转酮醇酶AtTKL1的三维结构。为进一步验证α-三联噻吩的作用靶标为转酮醇酶，试验对α-三联噻吩和AtTKL1进行了分子对接，研究发现α-三联噻吩可以与AtTKL1的活性口袋很好的匹配。除此之外，试验还利用荧光猝灭光谱法证实了转酮醇酶与α-三联噻吩之间存在结合作用。最后，本研究对拟南芥转酮醇酶Transket家族的成员进行了鉴定，获得了12个Transket家族成员，这些成员在植物的呼吸作用和光合作用中扮演着非常重要的角色。对各基因在不同组织器官中的表达模式进行分析，发现AT3G60750基因编码转酮醇酶基因AtTKL1，是植物光合作用中的关键基因。.本项目不仅可以从植物中探寻新的活性先导化合物，通过类推合成推动新农药的开发，而且可以通过研究植物源活性物质的作用机理，进而探寻出新的作用靶标，促进新型环境友好农药的开发。