枯草芽孢杆菌与黑曲霉的胞外酶降解烟嘧磺隆的协同增效机制

The damage introduced by the herbicide nicosulfuron is threatening our agricultural production and ecological environment, and the most feasible way to solve this problem is in-situ bioremediation by microorganism. It was found in our former study that the extracellular enzymes produced by YB1 strain of Bacillus subtilis and YF1 strain of Aspergillus niger colud degradate nicosulfuron synergeticly. In this research, based on acquiring the gene sequences of the three ectoenzymes which produced by YB1, the relevant enzymes will be obtained by gene expression, and the enzymes of YF1 are to be purified to screen out high degradating activity . Different enzymes which produced by both strains are mixed with different ratios and assayed in order to get the optimum degradating combinations. The degradation products of each enzyme will be analyzed to definite the action site, thus to clarify the function of ectoenzymes acting in the complementary metabolism. The degradating dynamics is to be measured to find the synergetic action site of the optimum combination. How the ectoenzymes bind to the molecular of nicosulfuron and where is the binding domain exists are to be explained by using the techniques of amino acid site-directed mutagenesis and bioinformatics analysis. This project will illustrate the degradation mechanism based on the molecular level and will lay an academic foundation on the research and application of the complex degradation microbial formulation and synergetic enzymic preparations.

烟嘧磺隆所造成的残留药害对农业生产和生态环境安全存在严重威胁，微生物的原位生物修复是解决其残留药害的有效途径。本课题组发现枯草芽孢杆菌YB1菌株和黑曲霉YF1菌株的胞外酶对烟嘧磺隆的降解具有增效作用。本研究在已明确YB1菌株所产生的3个主要胞外酶基因的基础上，拟通过基因表达的方法获得各基因的表达产物；对YF1菌株的胞外酶进行分离，筛选出具较强降解活性的胞外酶；将来源于不同菌株的酶进行组合，筛选出降解烟嘧磺隆的最佳胞外酶组合；通过对烟嘧磺隆的降解产物分析，明确各胞外酶对烟嘧磺隆的降解作用位点，进一步明确各胞外酶之间的互补代谢作用；通过测定各酶和最佳酶组合的降解动力学，明确最佳降解组合对烟嘧磺隆协同作用位点；利用生物信息学方法和氨基酸的定点突变技术明确胞外酶与烟嘧磺隆的结合区域。本研究不仅阐明胞外酶对烟嘧磺隆降解作用的增效机制，也为复合型降解菌剂及增效复合酶制剂的研究与应用奠定理论基础。

烟嘧磺隆所造成的残留药害对农业生产存在严重威胁，微生物修复是解决其残留药害的有效途径。本课题组在前期获得的烟嘧磺隆降解菌枯草芽孢杆菌YB1菌株和黑曲霉YF1菌株的基础上进行研究。在已明确YB1菌株所产生的锰结合ABC转运酶、植物过氧化氢酶1和乙偶姻脱氢酶E1的基因的基础上，通过体外诱导表达的方法获得各基因的表达产物；对YF1菌株的胞外酶进行分离，筛选到两种具降解活性的α-淀粉酶A和脂肪酶2，并对其进行体外诱导表达，得到纯化酶；将来源于不同菌株的酶进行组合，筛选出降解烟嘧磺隆的最佳胞外酶组合为乙偶姻脱氢酶E1和α-淀粉酶A组合；通过对烟嘧磺隆的降解产物分析，明确了各胞外酶以及酶组合对烟嘧磺隆的降解作用位点均为同一位点，均作用于烟嘧磺隆的磺酰脲桥位置，所以各酶之间降解作用属于相加作用，利用计算机分子模拟技术以及表面等离子体共振技术（SPR）初步研究了降解酶与烟嘧磺隆分子之间的相互作用机制，得知降解酶与烟嘧磺隆分子之间存在特异性结合作用，结合能的大小与实际的降解率保持一致。然后利用分子模拟技术确定植物过氧化氢酶1和脂肪酶2与烟嘧磺隆的结合区域，预测出了两者之间相互作用的关键氨基酸位点，随后通过氨基酸的定点突变技术对脂肪酶2进行突变，得到脂肪酶2的突变蛋白，并与未突变的脂肪酶2的降解活性进行对比，得知所预测的关键氨基酸位点与烟嘧磺隆降解活性有重要关系。最后对两个降解菌株进行了菌剂加工和制备，获得了使用方便的颗粒剂，分别在室内条件和室外条件下研究了颗粒剂对土壤中烟嘧磺隆残留的修复效果，均表现出了较好的修复效果，此外采用α-淀粉酶A进行了生物型种衣剂的加工，对敏感植物进行种子包衣，并在室内条件下证明了该种衣剂对土壤中烟嘧磺隆残留的修复效果，且优于菌剂的修复效果，值得推广使用。本研究不仅阐明胞外酶对烟嘧磺隆降解作用机制，也为复合型降解菌剂及降解酶制剂的研究与应用奠定了理论基础。