蓝细菌γ-氨基丁酸转氨酶的底物识别分子机制及催化机理研究

Previous study demonstrated that the protein encoded by slr1022 gene of Synechocystis sp. PCC6803 displayed the dual functions of gamma aminobutyric acid aminotransferase (GABA-AT) and N-acetylornithine aminotransferase (ArgD), which were the key enzymes in the GABA shunt of tricarboxylic acid cycle and amino acid metabolism pathway of Synechocystis sp. PCC6803, respectively. However, there was no report on the molecular mechanism of substrate specificity and catalytic mechanism of slr1022 protein yet. Studying the molecular mechanism of substrate specificity and catalytic mechanism of slr1022 protein is of great importance for understanding the tricarboxylic acid cycle and amino acid metabolism of cyanobacteria and exploring the molecular evolution mechanism of such transaminase. This project will focus on the slr1022 protein from Synechocystis sp. PCC6803. In this project, the substrate selectivity and structural basis of slr1022 as GABA-AT and ArgD will be studied systematically by homology modeling, mutagenesis, enzyme kinetic analysis combined with 1H NMR, mass spectrometry and protein crystallization technology, and the catalytic mechanism of slr1022 as GABA-AT and ArgD will be elucidated. The results of this study will not only provide reference value for the rational design of inhibitors of GABA-AT and ArgD, but also lay foundation for the production of renewable biofuels by genetically engineered cyanobacteria.

集胞藻PCC6803的slr1022基因编码蛋白具有γ-氨基丁酸转氨酶和N-乙酰鸟氨酸转氨酶功能，是集胞藻PCC6803三羧酸循环中γ-氨基丁酸代谢旁路和氨基酸代谢途径中的关键酶。然而目前还没有对其底物识别分子机制及催化机理的研究报道。研究slr1022蛋白的底物识别分子机制及催化机理对于深入理解蓝细菌的三羧酸循环和氨基酸代谢途径以及探索此类转氨酶的分子进化机制都具有重要意义。本项目将以集胞藻PCC6803中slr1022蛋白为研究对象，通过分子同源建模、靶点氨基酸定点突变、酶动力学分析结合氢核磁共振、质谱分析及蛋白质结晶等技术手段系统研究slr1022蛋白的底物选择性及其结构基础，阐明slr1022蛋白作为γ-氨基丁酸转氨酶和N-乙酰鸟氨酸转氨酶的催化反应机理，为γ-氨基丁酸转氨酶和N-乙酰鸟氨酸转氨酶抑制剂的理性设计提供参考依据，同时也将为基因工程蓝细菌合成可再生生物燃料提供理论基础。

集胞藻PCC6803中slr1022基因编码蛋白被报道具有γ-氨基丁酸转氨酶和N-乙酰鸟氨酸转氨酶功能，分别在三羧酸循环旁路代谢和精氨酸代谢途径中发挥了重要作用，然而目前还没有对slr1022蛋白具有γ-氨基丁酸转氨酶和N-乙酰鸟氨酸转氨酶活性的底物识别分子机制及催化机理研究。本项目以集胞藻PCC6803来源的slr1022蛋白为研究对象，研究了slr1022蛋白作为γ-氨基丁酸转氨酶的酶动力学特性，阐明了slr1022蛋白作为N-乙酰鸟氨酸转氨酶的结构-功能关系及催化机制，同时对slr1022蛋白的其他底物选择性进行了探索。研究结果表明slr1022蛋白同时具备N-乙酰鸟氨酸转氨酶、鸟氨酸转氨酶和γ-氨基丁酸转氨酶的催化活性，但是相对于N-乙酰鸟氨酸转氨酶，slr1022蛋白作为鸟氨酸转氨酶和γ-氨基丁酸转氨酶的活性较低，仅为其1/2400和1/10700。对slr1022蛋白作为N-乙酰鸟氨酸转氨酶进行生化表征，结果显示该酶最适pH为8.5；最适酶促反应温度为30℃；Mg2+，Ca2+，Mn2+等金属离子对其催化活性起激活作用，其中Mg2+激活作用最强；Ni2+，Co2+，Cu2+以及Zn2+等金属离子起抑制作用，其中Zn2+抑制作用最强；与底物AcOrn和a-KG的Km值分别为0.12±0.015 mmol/L和0.037±0.004 mmol/L。蛋白质定点突变和同源建模研究结果表明，Lys280、Asp251以及Gly163残基为slr1022蛋白作为N-乙酰鸟氨酸转氨酶的关键氨基酸：其中辅因子PLP通过Schiff碱共价结合到Lys280的ε-氨基上，形成内部醛亚胺，为反应催化的第一步；Asp251残基上的β-羧酸可能与PLP吡啶环上质子化的氮形成氢键或者盐桥，稳定质子化的氮上所带的正电荷，在酶催化过程中起到增强PLP作为“电子库”的功能。Thr308侧链羟基氧、Q254酰胺氮分别与辅因子PLP磷酸根上的氧和PLP上的羟基氧形成的氢键，对于PLP的稳定起到重要作用，而且还可能与反应的催化作用相关。Glu223、Tyr39、Arg163及Arg402残基与底物识别结合相关，其中Glu223可能在前后半反应中起开关的作用。在该基金项目的资助下，课题组共发表项目负责人为通讯作者论文5篇，其中SCI收录论文2篇，CSCD中文核心论文3篇。