蓝细菌a-酮戊二酸脱羧酶的结构-功能关系、催化机制及其催化不对称碳-碳键形成研究

Cyanobacterial a-ketoglutarate decarboxylase is a key enzyme in cyanobacterial three carboxylic acid cycle. However, these is no research report about the structure-function relationships and catalytic mechanism of cyanobacterial a-ketoglutarate decarboxylase. It is of great significance for in-depth understanding of cyanobacterial three carboxylic acid cycle and exploring the catalytic substrate diversity of a-keto acid decarboxylases family to study the structure-function relationships and catalytic mechanism of cyanobacterial a-ketoglutarate decarboxylase.. The A2770 gene of Synechococcus PCC7002 encoded an a-ketoglutarate decarboxylase. In this project the structure-function relationships and catalytic mechanism of A2770 protein will be elucidated by molecular homology modeling and protein crystallization, site-directed mutagenesis, enzyme kinetic analysis, 1H NMR, time-resolved circular dichroism spectroscopy and mass spectrometry techniques. Then the application of A2770 protein to catalyze the asymmetric synthesis of chiral 2-hydroxy ketone will be explored. Based on the aforementioned results the catalytic substrate diversity of a-keto acid decarboxylases will be further expanded, and also these results will lay the foundation for constructing genetically engineered cyanobacteria to biosynthesize alcohol fuels.

蓝细菌a-酮戊二酸脱羧酶是蓝细菌三羧酸循环中一个关键酶，然而目前还没有对其结构-功能关系及催化机制的研究报道。研究其结构-功能关系及催化机制对于深入理解蓝细菌的三羧酸循环和拓宽a-酮酸脱羧酶家族的催化底物多样性都具有重要意义。. 本项目将以聚球藻PCC7002中A2770蛋白为研究对象，通过分子同源建模及蛋白质结晶、靶点氨基酸定点突变、酶动力学分析、氢核磁共振、圆二色谱及质谱等技术手段阐明蓝细菌a-酮戊二酸脱羧酶的结构-功能关系及催化机制，在此基础上开展a-酮戊二酸脱羧酶不对称催化合成手性2-羟基酮研究，进一步拓宽a-酮酸脱羧酶家族的催化底物多样性，同时也为通过基因工程手段改造蓝细菌合成醇类燃料奠定基础。

蓝细菌a-酮戊二酸脱羧酶是蓝细菌三羧酸循环中一个关键酶，然而目前还没有对其结构-功能关系及催化机制的研究报道。研究其结构-功能关系及催化机制对于深入理解蓝细菌的三羧酸循环和拓宽a-酮酸脱羧酶家族的催化底物多样性都具有重要意义。本项目以聚球藻PCC7002中A2770蛋白为研究对象，阐明了A2770蛋白作为a-酮戊二酸脱羧酶的结构-功能关系及催化机制，同时对三羧酸循环途径中a-酮戊二酸脱羧酶下游的琥珀酸半醛脱氢酶进行了生化表征。研究发现A2770蛋白是一个TPP依赖的a-酮戊二酸脱羧酶，其最佳催化pH为7.0，最适温度为50℃，二价金属离子对其催化活性有激活作用。尽管A2770蛋白具有极低的乙酰乳酸合成酶活性，A2770蛋白具有严格的底物特异性，不能催化大部分其他a-酮酸底物。同时，作为a-酮戊二酸脱羧酶，聚球藻PCC7002的A2770蛋白的催化活性是来源于集胞藻PCC6803的a-酮戊二酸脱羧酶的500倍。催化活性差异较大的可能原因是这两种蓝细菌具有不同的从a-酮戊二酸到琥珀酸的代谢途径。定点突变和蛋白结构模拟研究表明A2770蛋白中的Asp432和Tyr462残基参与底物a-酮戊二酸的结合，Met407、Asp432和Tyr462残基参与了辅因子TPP的结合，Asp432残基在A2770蛋白结合金属离子过程中发挥了重要作用，Glu47残基参与了TPP到TPP叶立德的转化过程。同时，Asp432和Asp459残基在催化过程中可能作为质子供体或受体参与催化反应。由于a-酮戊二酸及琥珀酸半醛是蓝细菌生物合成燃料分子途径中的关键中间代谢物，本项目研究不但进一步拓宽了a-酮酸脱羧酶家族的催化底物多样性，同时也为通过基因工程手段改造蓝细菌合成燃料分子奠定了一定的基础。