ω-转氨酶对β-酮酸酯底物的识别机制及改造

ω-transaminase is a potential biocatalyst and has been used in the synthesis of high value optically pure chiral amines and β-amino acids. However, β-amino acids cannot be effectively prepared by this amino transfer reaction due to the decarboxylation of β-keto acids. β-Keto esters are more stable, and their use as amino acceptor will offer a solution to this problem. A new ω-transaminase has been identified from Burkholderia vietnamiensis (HBV-ω-TA) by our team. The enzyme has a broad substrate specificity and excellent enantioselectivity towards short-chain aliphatic β-keto acid ester, but it exhibited no activity toward aromatic β-keto acid ester. In this project, we will investigate the relationship between the structure of HBV and substrate specificity, to reveal the catalytic mechanism of HBV. The results will lay a solid theory foundation for the modification and design of transaminases to produce β-amino acids. At the same time, the HBV will be rationally designed and evoluted to identify some mutant enzymes which show high activity and enantioselectivity towards aromatic β-keto acid esters, and could be applied to the synthesis of aromatic β-amino acids.

ω-转氨酶是一类非常有应用潜力的生物催化剂，已逐步应用于高附加值的光学纯手性胺和氨基酸的合成中，但在合成重要的医药中间体手性β-氨基酸时，由于β-酮酸底物容易自发脱羧，导致β-氨基酸的产率很低。以β-酮酸酯为底物可以解决β-酮酸不稳定的难题。我们前期研究工作获得的越南伯克氏菌ω-转氨酶具有广泛的底物谱和高的立体选择性，对于短链脂肪族β-酮酸酯的催化活力较高，但对芳香族β-酮酸酯无活力。本课题以该ω-转氨酶为研究对象，运用生物信息学分析、同源建模、酶与底物的分子对接、多位点突变等方法，解析越南伯克氏菌ω-转氨酶对β-酮酸酯的底物结合机制，为ω-转氨酶用于不对称合成β-氨基酸的改造提供理论基础。并以此为基础，对该酶进行理性设计和改造，以期获得能够合成芳香族β-氨基酸，并具有高活性和立体选择性的突变酶。

ω-转氨酶是一类非常有应用潜力的生物催化剂，已逐步应用于高附加值的光学纯手性胺和氨基酸的合成中，但在合成重要的医药中间体手性β-氨基酸时，由于β-酮酸底物容易自发脱羧，导致β-氨基酸的产率很低。以β-酮酸酯为底物可以解决β-酮酸不稳定的难题。我们前期研究工作获得的越南伯克氏菌ω-转氨酶具有广泛的底物谱和高的立体选择性，对于短链脂肪族β-酮酸酯的催化活力较高，但对长链及芳香族β-酮酸酯无活力。本课题以该ω-转氨酶为研究对象，通过同源建模和分子对接，基于ω-转氨酶双底物结合口袋模型对HBV活性中心内氨基酸残基进行半理性设计，构建了饱和突变体库，并建立了一种可视化的高通量筛选方法。通过迭代饱和突变获得了一系列的突变体，对其酶学性质及催化性质进行了研究，解析了ω-转氨酶HBV对β-酮酸酯的底物结合机制。获得的最终突变体HBV_L57A/W58F/F86M/154S/I260V对野生型酶不具有活性的长链脂肪族β-酮酸酯底物丁酰乙酸乙酯、异丁酰乙酸乙酯及特戊酰乙酸乙酯酶活分别达28.03mU/mg、39.51mU/mg和38.52mU/mg，且对直链脂肪族β-酮酸酯类底物具有极高的立体选择性（ee>99%），为不对称合成光学纯β-氨基酸奠定了研究基础。同时，利用ω-转氨酶对取代的β-或γ-酮酸酯进行动态动力学胺化研究，产物能够自发环化生成具有两个手性中心的γ-和δ-内酰胺。对反应条件如pH、助溶剂和氨基供体比例进行了优化，通过半制备规模的放大反应，获得了相应的内酰胺和胺，收率50–80%，对映体比例最高达到99:1，ee>99%，该研究为合成具有两个手性中心的γ-和δ-内酰胺类化合物提供了新的路径。