倍增基因IGFBP-1a/1b 对分解代谢胁迫条件响应机理的研究

The insulin-like growth factor-binding proteins (IGFBPs) are evolutionarily conserved components of the insulin-like growth factor (IGF) system. The six forms of IGFBPs (IGFBP-1 to 6) bind the IGF ligands (IGF-1 and IGF-2) with high affinity and regulate the IGFs available to their receptors. IGFBP-1, the first identified member of the IGFBP family is highly reducible at the transcription level under variety of catabolic conditions, such as food deprivation, malnutration and hypoxia. The biological significance of IGFBP-1 was said to serve as a molecular switch by controlling the availability of IGFs to their receptors and to divert the limited energy resources away from growth and development towards those metabolic processes essential for survival. How does it works? The differences and mechanisms of The duplicated gene IGFBP-1a/1b in response to catabolic conditions (fasting, malnutrition and hypoxia) will be studied in vitro (cell lines) and in vivo (zebrafish model). The activity of the response elements on the promoter region and Serine residues to be phosphorylated in and close to the C-domain of IGFBP-1a/1b will be compared. The understandings of the molecular basis of IGFBP-1 regulation under stress condition will be help to establish a kind of biomarker for evaluating the catabolic condition and growth. Even more,it will be helpful for FGR (fetal growth restriction) research and treatment, and fish growth control under stress.

胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs）是进化上保守的IGF 信号系统的组成部分。IGFBP-1 是IGF 结合蛋白家族6 个成员中第一个被发现和鉴定的成员，一些分解代谢胁迫条件会诱导其在转录水平高表达，被喻为响应胁迫条件的分子开关"ON/OFF"。本项目将以斑马鱼为模式动物，结合人的细胞模型，进行倍增基因IGFBP-1a/1b 对分解代谢胁迫条件（如禁食、营养不良、缺氧）响应的差异及其机理研究，特别关注其启动子区域的特征，以及蛋白结构中关键Serine（如与过渡磷酸化有关的Serine）对其活性的影响，深入研究具有分解代谢胁迫条件指示作用的IGFBP-1 的调控机理。其响应机制的阐明，将在以其作为关键分子进行生长调控、治疗FGR 等方面都具有潜在的应用价值，也为探讨鱼类IGFBP-1 作为指示生长与胁迫条件的分子标记提供直接实验证据；构建的斑马鱼突变体模型为相关研究提供体内功能研究工具。

本项目以斑马鱼为模型，首先研究不同饲喂量和饲喂成分对成鱼和稚鱼体内IGF-1、IGF-2和IGFBP-1 mRNA表达水平的影响。成鱼经饥饿及再饲喂，其igf1和igf2表达量与体长体重较一致，在对照组中持续上升，而在饥饿组中很低，再饲喂体长体重有所上升而igf1和igf2表达量仍持续走低，没有回升。igfbp1的表达变化与体长体重的变化相反。不同饲喂量的稚鱼，其体长体重在0%和1%饲喂组中很低，随着饲喂量的增加而显著上升，igf1和igf2在0%、1%和3%饲喂组中表达量相当，而在9%饲喂组中表达水平显著上升。但是igf2的变化幅度显著高于igf1。igfbp1在饥饿组中表达量最高，而在其他3组中表达量相当。在稚鱼不同营养成分实验中，低糖、高蛋白、高脂和高维生素饲喂组中，稚鱼的体长体重与对照组相当，均高于高糖、低蛋白、低脂和低维生素组。igf1a的表达量比igf1b显著，且在低糖、高蛋白、高脂和高维生素组中的表达量最高。igf2a在碳水化合物和脂肪组的表达变化高于igf2b，而在蛋白质和维生素组中与igf2b表达量相当。igfbp1在低糖和低蛋白组中表达量最高，在低脂组igfbp1b表达量较高，而低维生素组中igfbp1a表达量较高。以上实验表明IGF系统在营养与生长的关系中发挥重要的作用，可以作为分子水平上的指标。其次，生物信息学分析发现igfbp-1a含有两个保守的AARE元件，其中一个位于转录起始位点上游-1454/-1446区域：TGATGCAAC；另一个位于第一个内含子的+483/+491区域：ATTTCATCA。igfbp-1b中并没有发现类似的AARE保守序列。采用报告质粒在HepG2细胞中进行启动子响应活性的检测，证实斑马鱼igfbp-1a转录起始位点上游的AARE元件对亮氨酸缺乏有响应。此外，还制备了斑马鱼Igfbp-1a、Igfbp-1b的多克隆抗体，可以用于斑马鱼Igfbp-1a和Igfbp-1b的蛋白检测。项目期间还采用TALENs和CRISPR/Cas9技术制备了斑马鱼倍增基因igfbp-1a、igfbp-1b敲除纯合突变体，将对深入研究igfbp-1a、igfbp-1b从胚胎发育期至成体期的整个生命周期中的功能具有重要意义，也为更加深入的研究倍增基因igfbp-1a、igfbp-1b在胁迫条件下的响应分子机制提供了平台。