扁蓿豆抗寒相关基因对低温胁迫响应机理的研究

The development of alfalfa planting and grass industry in the northern cold regions were largely limited, due to the lack of excellent alfalfa varieties which have strong cold resistance and high yield. It is an important way to solve the problem that explore and use of plant genetic resources have cold resistance and accelerate the cultivation of new varieties of alfalfa. Medicago ruthenica is a perennial legume diploid plant in Medicago. It has excellent characteristics such as strong thrips resistance, strong cold and drought resistance. It is ideal material to improve the resistance of alfalfa for genetic improvement. In this study, Medicago ruthenica(L.)cv.Zhilixing will be taken as material. Morphology, nutrient accumulation and physiological and biochemical changes related stress will be comparative analysised in the field and cold stress. Temporal and spatial expression characteristics of the cloned three cold-related genes of Medicago ruthenica and differentially expressed in different alfalfa materials will be studied using known genetic background of Medicago truncatula ,at the same time ,the correlation with morphology, physiological and biochemical changes will be revealed . They will lay the foundation for molecular marker and transgenic alfalfa breeding on cold resistance and yield of alfalfa.

由于抗寒高产的优良苜蓿品种短缺，在很大程度上限制了我国北方寒冷地区苜蓿的种植及其草产业的发展，发掘和利用抗寒植物基因资源，加快抗寒苜蓿新品种培育是解决该问题的重要途径。扁蓿豆是苜蓿属多年生二倍体植物，具有抗寒、抗旱、抗蓟马等优良特性，是遗传改良提高苜蓿抗逆性的理想材料。 本项目以直立型扁蓿豆为主要研究对象，在大田自然环境和人工控制的低温胁迫条件下，比较分析扁蓿豆不同生长状态下各器官形态结构、养分累积规律及与逆境胁迫相关的生理生化指标的变化。利用已知蒺藜苜蓿的遗传背景，研究已克隆的3个扁蓿豆抗寒相关基因的时空表达特性及在不同苜蓿材料上的表达差异，并分析其与各材料形态结构、生理生化变化的相关性。进一步通过遗传转化验证其抗寒功能，探讨扁蓿豆抗寒功能基因在低温胁迫下的响应机理，明确其对紫花苜蓿遗传转化后的抗寒效果，为苜蓿的抗寒高产分子标记辅助育种及转基因育种奠定基础。

深入挖掘苜蓿属牧草的抗寒基因资源，揭示其抗寒机理，为苜蓿属牧草的抗寒育种研究提供理论依据。以该属抗寒性较强的直立型扁蓿豆为材料，低温冷诱导3-5叶期幼苗，利用cDNA-AFLP和RT-PCR同源序列克隆技术，筛选克隆扁蓿豆抗寒相关基因，进一步通过荧光定量PCR技术和生理生化指标测定，分析扁蓿豆抗寒相关基因与其他植物抗寒基因的差异、表达时期及基因表达与生理生化指标间的相关性等表达特性，为明确其抗寒机理奠定基础。.1．直立型扁蓿豆幼苗的叶、茎、根对低温有不同程度的响应，可溶性糖含量和POD活性最先在根中提高，最高水平量是对照可溶性糖和POD活性量的3.64和1.64倍；可溶性蛋白和SOD活性最先在叶中提高，最高水平量是对照可溶性蛋白和SOD活性量的1.52和2.12倍。可溶性蛋白、SOD酶活性和POD酶活性间存在显著相关性，说明扁蓿豆在低温胁迫条件下提高渗透物质含量和抗氧化物酶活性来抵御寒冷。.2．扁蓿豆Actin、CAS15A和CAS15B基因，与苜蓿的Actin和CAS基因相似率高达93%以上。其中扁蓿豆Actin基因在不同温度处理下的叶、茎、根中表达均无差异，可作为后期定量分析的内参基因；扁蓿豆CAS基因的核苷酸序列含有CRT/DRE（TACCGACCA）低温应答元件，同时氨基酸序列具有与其他植物CAS基因相似的4个相关位点、4次重复的10肽序列的低温相关位点和序列；扁蓿豆CAS15基因属于CAS冷诱导基因家族，在冷处理72h和84h达到相关表达量最高水平，推测CAS15的表达增强了扁蓿豆的抗寒性。.3．选取其中58条上调表达的差异片段进行功能预测，主要参与光合作用、呼吸反应、细胞信号转导、物质代谢、防御反应等生理过程，其中70.79%的差异片段序列与蒺藜苜蓿的相关序列高度一致。通过qRT-PCR对其中7个有特点的基因进行量化分析证实均参与低温调控。.4．扁蓿豆抗寒相关的MRPP2C、MRHSP70、MRHLH的cDNA，其编码蛋白分别具有PP2C、HSP70、HLH的保守域，与蒺藜苜蓿及其他植物的相应基因编码氨基酸序列具有很高相似度。其中MRHLH与MRCAS15基因表达量呈显著正相关，SOD酶活性也与抗寒相关基因MRHLH、MRCAS15A、MRCAS15B呈显著正相关。