铜绿假单胞菌合成鼠李糖脂对环境胁迫条件的响应机制研究

As the most important type of biosurfactant, rhamnolipid has the advantages of nontoxic and biodegradable, and it could be a potential alternative to the chemical surfactants available on the market. However, its industrial scale production is currently limited by high raw material costs and low manufacturing output. Pseudomonas aeruginosa is the most widely used rhamnolipids producer. Stress conditions are among the conditions that favor higher levels of rhamnolipids synthesis in P. aeruginosa, but the underlying mechanism of this phenomenon has not been elucidated and effectively applied to rhamnolipids production. In this research, we will try to find out the key regulatory factors involved in the response of rhamnolipids synthesis to stress conditions. Transcriptomics will be utilized to analyze the gene expression profiles of strains grown under stress conditions or normal condition. Subsequently, the expression of the indentified regulatory factors will be modified by gene knock-out or gene over-expression, according to the corresponding regulatory mechanisms. The final purpose of this research is to construct a genetic engineered strain that can simulate the response of rhamnolipids synthesis to stress conditions, which will facilitate rhamnolipids production by P. aeruginosa. This research will not only further elucidate the regulatory network of rhamnolipids production, but also provide an illustration of promotion of strain's production capacity by engineering its regulatory network.

鼠李糖脂类表面活性剂具有无毒，能生物降解等特点，可以作为化学合成表面活性剂的替代品，然而生产成本高，产量低的问题成为限制其进一步推广应用的关键。铜绿假单胞菌是鼠李糖脂最主要的生产菌株，其合成过程受到部分环境胁迫条件的促进。然而该促进作用的内在响应机制尚未完全阐明，并且其未被有效的利用于鼠李糖脂的生产过程。本研究项目希望借助转录组学技术，对促进作用显著的环境胁迫条件和正常生长条件下菌株的基因表达谱进行分析比较，寻找这一响应现象中关键的特异性调控因子；并根据相应机制，通过基因敲除或过表达等手段，对上述调控因子的表达量进行调整，尝试构建能针对性地模拟环境胁迫条件对鼠李糖脂合成促进作用的工程菌株，以达到提高鼠李糖脂产量的目的。上述研究不仅可以进一步阐明铜绿假单胞菌合成鼠李糖脂的调控网络，同时可以为通过改造调控网络促进微生物工业应用能力提供科学例证。

鼠李糖脂是研究最为广泛和最具市场潜力的生物表面活性剂之一，主要由铜绿假单胞菌进行生产。利用鼠李糖脂替代化学来源表面活性剂进行应用最大的限制在于其生产成本高而产量低。在改进鼠李糖脂生产技术的相关研究中，传统的优化方法取得了一定进展，但是总体上效果仍未达到人们的需要。对鼠李糖脂合成途径的调控和诱导机制进行分析，寻找新的突破点，被认为是开发新一代鼠李糖脂生产技术的有效方法。铜绿假单胞菌合成鼠李糖脂的代谢途径目前已基本阐明，其相关调控网络涉及多类调控因子或信号物质，但是通过改造其调控网络帮助鼠李糖脂的生产尚未有研究报道。本研究首先建立生产鼠李糖脂生产菌株的筛选方法及相应发酵体系，考查了不同环境胁迫条件对鼠李糖脂发酵的影响，但是未发现能明显促进鼠李糖脂产量的条件。通过对鼠李糖脂合成关键基因簇（rhlAB）调控网络的分析，选择并完成了对铜绿假单胞菌PAO1 的PtxR 和AlgR 调控因子编码基因的敲除，并进一步构建了两个基因的双敲除菌株。通过摇瓶发酵实验验证，各突变菌株均能够提高鼠李糖脂的合成量，双敲除菌株提升效果最明显。通过荧光定量PCR 验证突变菌株中鼠李糖脂合成途径中关键基因rmlD，fabG 及rhlB 的mRNA转录水平，结果显示各突变菌株中rhlB 转录水平显著提高，且变化趋势与鼠李糖脂产量提高水平相符合，而rmlD，fabG变化不明显。通过5L 反应器反应验证了各突变菌株在拟实际生产条件中能够实现发酵产量提高的效果。通过对产物的提取及一级质谱检测，确定双敲除突变菌株中单鼠李糖脂的含量显著提高，因此推测本研究对鼠李糖脂代谢途径的影响主要是作用于rhlAB 基因簇，而未对rhlC 基因构成影响。本研究通过采用铜绿假单胞菌模式菌株构建的调控网络改造方法能够提升鼠李糖脂产量，并有望应用于其他菌株，为开发新型鼠李糖脂生产技术具有重要意义。