免疫佐剂激发PCV-2感染的分子机制

本课题研究在有或无免疫佐剂的刺激条件下，将PCV-2感染抗体阴性的长白仔猪, 并研究接种猪在潜伏期内体内的如下动态变化指标：以荧光定量PCR研究PCV-2在猪体内的增殖动态变化；以抗体捕捉ELISA研究PCV-2特异性IgG、IgM抗体水平的动态变化；采用基因芯片技术获得PCV-2感染猪外周血单核细胞(PBMC)在不同实验组之间、同一实验组的不同感染时机之间基因动态表达变化的全部可能的信息，着重分析细胞因子(白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、趋化因子)、猪白细胞分化抗原分子、黏附分子和急性期反应蛋白等与免疫、感染、疾病发生等相关蛋白因子转录本的水平，以及转录调控因子的转录水平的变化，并与感染过程中血液中的病毒含量、PCV-2特异抗体的水平高低，并参考发病猪的临床与病理变化等指标进行综合分析，从而阐明免疫佐剂激活PCV-2感染的分子机制。

首先探索PCV2感染仔猪的发病模型，然后以昆明小鼠为实验动物建立有效的PCV2感染动物模型。结果表明：PCV2能在小鼠体内有效复制，引起小鼠的组织损伤与仔猪的一致；PCV2可致小鼠的繁殖障碍，繁殖障碍率达18.75%,新生小鼠的发育不良和死亡率分别达19.5%和3.2%；与细菌混合感染有明显的致病协同作用。这3个方面均与PCV2感染猪的临床表现一致。这是PCV2感染小鼠模型的首次系统性的研究，可为PCV2感染的研究提供很好的动物模型。. 弗氏佐剂能显著增加小鼠脾脏内巨噬细胞的数量，并且增殖活跃的细胞有利于PCV2的繁殖，而机体的免疫功能受到抑制，这两方面的原因使感染鼠的病毒载量大幅度上升，疫病的发生加重。其机理是弗氏佐剂可使小鼠脾脏内CD4+T细胞/脾细胞百分比显著下降（10.59±0.96），与对照组（30.41±1.08）比较差异极显著（p < 0.01）；14种Th1相关基因、13种Th2相关基因和7种CD4+T细胞标志性基因的表达水平下降；感染小鼠脾脏内Tregs的数量及Th17细胞相关的IL-17和IL-23的表达水平显著提高，这些表明PCV2感染使机体的免疫功能普遍受到了抑制作用，这可以很好地解释PCV2的致病原因；.本研究发现圆环病毒感染对动物的血清氨基酸水平变化具有明显的影响，在感染后第7天 ，共有9种氨基酸的水平明显下降，其作用机制之一是通过影响肠道氨基酸转运载体的表达。而日粮中提高精氨酸或者谷氨酰胺的水平对圆环病毒感染小鼠和仔猪血清中的细胞因子水平有一定的改善, 可减少体内圆环病毒的含量和圆环病毒对组织的损伤，有利于动物抵抗病毒的感染；这些作用可能是通过一氧化氮途径发挥的。这是首次有关通过营养调控可以降低PCV2危害的研究报道，为养猪业控制PCV2感染的危害开辟了一条新的途径。. 用亲和层析纯化的PCV2多克隆抗体从噬菌体筛选到了8个抗原表位或其核心区域，其中　53FGYT5686、SNPRSVPF93和 103KVEFWP108三个表位既不是任何已知的表位或表位的核心区域，也不位于任何已确定的抗原区域，是本研究发现的3个全新的表位。用亲和层析纯化的多克隆血清一次即从噬菌体多肽文库中筛选到8个表位，这说明使用Mcab筛选抗原表位要有优越得多。这一方法的普遍应用将可有力推动病原微生物的抗原表位的相关研究。