活细胞近膜区域分子相互作用无标记实时检测方法

活细胞膜表面的分子表型信息的获取能够为细胞组学研究和药物发现提供可靠的依据，相应的检测方法亟需有新的突破。基于SPR传感，建立细胞层次上分子水平检测的数学模型，研究多波长的光源对细胞进行分层检测的机理，制备可重复使用的活细胞芯片，构建高灵敏度、实时、无标记和荧光标记两用的活细胞检测系统，设计传感信号实时采集、处理算法与软件。在此基础上，以胃癌细胞BGC823和AGS等为模型，开展在细胞周期不同时期如Go、G1、S和G2/M等的细胞形态与膜蛋白水平的差异、细胞近膜区域中膜蛋白S100A14和EGFR与相应配体的相互作用、由其引发的胞内分子响应以及胃癌化疗药物如5-FU对活细胞刺激的检测实验，积累和解析实验数据，并与Western Bolt及ELISA方法进行对比，初步找出胃癌相关的特征数据，为膜蛋白组学提供新数据，为胃癌诊断、治疗及药物筛选提供依据，为细胞组学研究提供新方法和新工具。

细胞内分子间相互作用的检测对研究分子功能及其作用机制，发现新的药靶具有重要意义。本项目基于SPR传感，针对生物分子与细胞相互作用的特点，构建了2种实验装置，实现了活细胞动态变化的实时检测。.理论方面，通过分析SPW的穿透深度与激发光波长等关系，明确了激发波长越长，倏逝波场在传感层中的穿透越深，可选择不同激发波长来表征细胞不同深度的信息。接着，建立了SPR传感检测细胞的物理模型，研究表明，不同波长光所激发的SPR对相同传感层的灵敏度不同；同一波长对不同传感层的灵敏度不同。因此，可采用双波长或多波长同时检测，获得2个或多个不同的SPR传感信号，再根据灵敏度差异进行解算，获得细胞活动的细微变化信息。.根据理论分析，构建了基于振镜扫描的单细胞检测实验装置，提出并实现了新颖的相移法解算谐振角法，将ATR曲线变换到了频域处理，显著增强抑制噪声能力，其特点：一是动态范围大，达到1.33-1.38；二是灵敏度高，可达1.8×10-6RIU，能检测各种细胞与小分子相互作用。同时，在所研制的“高通量相位检测生物分子相互作用分析仪”的基础上，构建了多细胞及单细胞阵列的检测装置，设计了专用于细胞检测的恒温控制微流体系统，有利于细胞的芯片上培养。.细胞芯片是检测的基础。分析了现有芯片修饰方法后，设计了6种方法进行对比实验，优选出了最佳的一种：先在金膜上镀SiO2膜，再包被PLL，既可保护金膜，又能构建亲水基底，促进细胞贴附，缩短培养时间，维持细胞活性。并且，优化了细胞芯片的制备方法和相关条件。测试细胞的片上培养状态后，又完成了2种检测：.在正常和固定的人胃癌BGC823细胞上，进行其膜蛋白EGFR与对应抗体EGFR1相互作用的检测，与免疫荧光实验对照，结果表明能敏感地检测到细胞表面的分子反应。.利用抗癌药物大蒜素，对胃癌BGC823细胞进行刺激，检测其响应。对照实验表明，受刺激和未受刺激细胞的SPR信号响应值分别为0.15和0.35 RIRF，差值明显。结合形态变化观察，可得出，癌细胞受大蒜素刺激后被抑制，有助于理解和分析大蒜素的抗癌作用机理。.除上述外，还与SFG联用，检测了MSI-78与POPC、POPC/POPG磷脂膜的相互作用，综合研究结果，可得出：当MSI-78浓度达到一定时，能在磷脂膜上形成环形穿孔，破坏磷脂膜，从而导致细胞破裂，这是其抗菌作用的基本机理。