hTERT启动子和缺氧诱导因子-1双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒介导的超抗原SEA基因靶向灌注治疗膀胱癌

超抗原能直接激活比普通抗原多达数千乃至数万倍的细胞毒T淋巴细胞（CTL）进而产生强大的抗瘤效应，但缺乏靶向性和特异性。我们将肿瘤特异性人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子和缺氧诱导因子-1（HIF-1）分别插入病毒复制所必需的E1A、E1B基因启动子删除的腺病毒质粒，构建仅在肿瘤细胞内特异性增殖的溶瘤腺病毒（RSOAds），并以此为超抗原SEA基因载体，包装成能在肿瘤细胞内特异性增殖、具有强大细胞毒作用的高靶向双调控增殖溶瘤腺病毒-超抗原SEA载体质粒（SG502-SEA）。检测SG502-SEA体外特异性刺激T细胞增殖和双重抗瘤能力；并建立小鼠原位膀胱肿瘤模型，通过膀胱灌注的方法使双调控增殖溶瘤腺病毒-超抗原SEA质粒直接到达肿瘤局部，限制其在瘤区发挥作用，观察荷瘤鼠生存时间、采集肿瘤组织及重要脏器标本通过多种免疫和病理学检测研究其靶向叠加抑癌效果，探索新的膀胱癌免疫治疗方法

在本课题中，我们应用酶切、连接方法将hTERT 连接于腺病毒穿梭质粒E1A和E1B 序列之前调控E1A 和E1B 蛋白的表达，CMV 启动子和SV40 分别调控目的基因SEA 的表达和终止，利用脂质体将腺病毒骨架质粒和穿梭质粒共同转染人胚肾293 细胞( HEK-293) 进行同源重组，获取选择性复制腺病毒CMVSV40-hTERT( CSS-H) ，氯化铯梯度离心纯化重组腺病毒，并测定病毒滴度。应用PCR 验证、双酶切分析、序列测定等方法验证重组质粒基因片段连接正确无突变，通过同源重组获得携带超抗原SEA 基因片段的CSS-H 重组腺病毒，测定滴度为2.9×1010 pfu /ml。. 以不同浓度溶瘤腺病毒感染鼠膀胱癌细胞，生物倒置显微镜下动态观察细胞形态变化，RT-PCR 检测SEA 在细胞内mRNA 表达，Western blot 检测SEA 蛋白表达。镜下可见细胞感染腺病毒并最终裂解，RT-PCR 和Western blot 分别检测到实验组mRNA 和蛋白的表达。可见携带SEA 基因的hTERT/HIF 双调控溶瘤腺病毒可在鼠膀胱癌细胞内复制增殖并表达SEA 基因，可用于治疗鼠膀胱癌的动物实验研究。. 建立小鼠膀胱癌动物模型后分两组，一组瘤内注射生理盐水，一组瘤内注射携带SEA基因的双调控溶瘤腺病毒，观察小鼠肿瘤的体积和瘤重，RT-PCR法和Western Blot法分别检测瘤内SEA mRNA和蛋白的表达，免疫组化观察瘤内T淋巴细胞表达，病理观察小鼠的肿瘤，肝和肾。实验组肿瘤体积和瘤重明显小于对照组，实验组瘤内可检测到SEA mRNA和蛋白，T淋巴细胞表达呈强阳性，肿瘤组织内有较多的纤维组织，肝肾无明显的病理变化。所以携带SEA基因的双调控溶瘤腺病毒具有一定的抗膀胱癌作用且无明显的毒副作用。