一组以环酯肽为底物的细胞色素P450的酶学性质及底物识别机制研究

The cyclic depsipeptide antibiotics have good inhibitory effects on many drug-resistant superbugs, and they have become one of the hotspots in pharmaceutical sector and the academia. The modification the depsipeptide backbone is one of the important factors that determine the physiological effects of these antibiotics. Hmt series of cytochrome P450 (HmtT, HmtN, HmtS) use structurally similar depsipeptide molecules as substrates, but they catalyze different reactions. Especially, HmtS catalyzes the coupling reaction between the cyclic depsipeptide monomers to generate the symmetric dimer cyclic depsipeptide, which is the only such reaction reported in the literature. So far, their catalytic capability has only been studied with knockout experiments. The in vitro characterization has yet been carried out. The project intends to characterize the enzymatic properties of these three enzymes. Meanwhile, the enzyme-substrate complex crystal structures will be determined. Through structural analyses and mutagenesis experiments, we will investigate their catalytic mechanisms, substrate recognition patterns and substrate transport channels. Based on this information, the differences in their substrate binding patterns and catalytic mechanisms will be studied, which will be used to explain the reasons why these enzymes can distinguish small differences between the substrates and catalyze totally different reactions. This project will not only deepen our understanding of the catalytic mechanism of substrate selectivity of cytochrome P450 enzymes, but also lay a good foundation for the upgrading of the cyclic depsipeptide antibiotics.

环酯肽类抗生素对多重抗药的超级细菌具有良好的疗效，是医药界和学术界关注的热点之一。对环酯肽骨架的修饰是决定此类抗生素生理功效的重要因素之一。 Hmt系列细胞色素P450（HmtT、HmtN、HmtS）以类似的环酯肽分子为底物，但催化完全不同的反应。其中，HmtS催化环酯肽间的偶联反应，是有文献报道的唯一一个生成环酯肽对称二聚体的酶促反应。现阶段对它们催化能力的认识都来自基因敲除，对其酶学性质的研究还没有开展。本项目拟对这三个酶的酶学性质进行表征；同时确定酶-底物复合物的晶体结构，并通过结构分析和突变试验来阐明它们的催化机理、底物结合方式及底物转运通道。在此基础上，比较这三种酶在底物识别机制和催化机理上的差异，以阐明它们区分底物间微小差异并催化不同反应的原因。本项目的实施不仅将加深我们对P450酶底物选择性及催化机理的认识，还能为环酯肽类抗生素的改良打下良好的基础。

在项目实施过程中，我们解析了环酯肽羟化酶HmtN的高分辨率晶体结构（1.3 Angstrom）。结构分析表明，HmtN具有典型的细胞色素棱柱状结构，由12个α螺旋和14个β链组成。几乎所有的HmtN表面都具有负静电势，只在很少的区域有正静电势。HmtT的几乎整个催化活性中心都是带负电荷的，而HmtN的催化活性中心一部分区域带正电荷而另一部分区域带负电荷。这可能与他们特定的底物特异性和不同的催化功能有关。为了探讨HmtN催化的反应机理，我们试图获得底物与HmtN的复合物，但是没有成功。于是，我们模拟了HmtN/底物分子的复合物。建模结果表明HmtN的活性位点可以很容易地容纳底物。此外，我们用CAVER3.0.1来预测蛋白质结构中可能的通道。HmtN的晶体结构有很高的分辨率，在其中可以观察到三个底物和产物转运的通道。在通道3中有很多芳香族残基，如Phe53，Phe69和Tyr287，他们可能起到识别和引导底物到达活性中心的作用。通道1和通道2可能是溶剂和水的通路。我们以P450酶HmtT（PDBID：4GGV）作为搜索模型，通过分子置换解析了P450酶HmtS的结构。对HmtS的晶体结构进行了优化，探索了活性中心开口处的三维结构。PISA结构分析显示，HmtS可以形成二聚体。催化口袋由B-C环，F-G环，β1-β2环和β12-β13环组成。延伸的F-G环为大的底物分子提供了足够的空间。然而，HmtS中β12-β13环的长度短于HmtT和HmtN的，这可能与其底物特异性有关。.此外，我们在环酯肽的生物合成和纯化的工作中也取得了重要进展。我们利用三丁酸甘油酯从土壤中筛选出了几个赖氨酸芽孢杆菌、类芽孢杆菌和含铜菌菌株。用这些菌株，构建了一个人工微生物群落。该群落能够用重要污染物（萘或蒽）作为唯一碳源，并产生酯肽类表面活性剂。我们用LC/MS对两个新的酯肽亚型进行了结构鉴定，并用FTIR、NMR和分子网络分析进行了验证。结果显示，这两个表面活性剂分子具有7元肽环结构，和surfactin的结构类似。这类肽环由一个beta羟基酸封闭，其侧链上有一个不饱和的烷烃结构。我们观察到赖氨酸杆菌对三丁酸甘油酯的高趋化活性，这是以前没有报道过的。我们的研究结果显示，碳氢化合物的降解和环肽类表面活性剂的产生是非污染土壤群落的潜在能力之一。