阿特拉津脱氯酶分子定向进化的研究

阿特拉津是世界范围内广泛使用了50多年的廉价除草剂。2-位上因携带氯原子使其变成农业和人居环境污染物。其环境污染已被联合国环境暑列为当前"急需解决的实际问题"。植物修复尽管是环境修复重要方向，但现有基因的修复效果远不及人们预期。因此，国外有人通过定向进化试图优化其特性，但实验设计及筛选通量的不足，其进化效果并不理想，策略上需要改进。在前期实验中，我们发现雨生红球藻对阿特拉津异常敏感，是阿特拉津脱氯酶突变子理想的超高通量筛选平台。基于此发现，本项目拟通过"雨生红球藻lcyB定点插入+选择压力提高"超高通量方法对突变文库进行大规模筛选，以获取酶活性提高10倍以上的超级基因，再通过酶功能分析、生物信息学和酶动力学分析阐明其功能域和酶学机制，为应用转基因植物高效修复阿特拉津污染环境、为应用阿特拉津机械化生产高纯度杂交稻种子、为开发廉价植物转基因标记系统提供酶学基础和理想的、具有知识产权的抗性基因。

阿特拉津氯水解酶近几年已经引起了越来越多人们的关注，因为它能将有毒的阿特拉津转变为无毒的羟基阿特拉津。由于它自身的这种优势，所以可用来降解环境中有毒的阿特拉津。正是看中这种特质，本研究对阿特拉津氯水解酶进行了定向进化，以期望得到酶活力提高的突变子，从而为环境中阿特拉津的生物降解提供试验材料。但是，阿特拉津氯水解酶在大肠杆菌中以包涵体的形式存在，这大大限制了大肠杆菌在筛选体系中的作用。为了克服这种障碍，本研究利用一种基于雨生红球藻的高通量筛选方法，在随机突变文库中成功获得了大量耐高浓度(1.0 μg/mL)阿特拉津的突变株，该突变株耐阿特拉津的浓度提高了10倍(野生型最大耐受能力是0.1 μg/mL)。对它们进行克隆、表达、复性，测定了酶比活力及动力学参数的测定。它们的比活力提高显著，是野生型的2.7到5.0倍，而且催化效率(kcat/Km)也提高至野生型的2.5至4.1倍。序列分析显示，酶活力提高最明显的两个突变体(10-7、21-1)为单氨基酸替换突变子，这表明其替换位点Val12或Leu395对酶功能的发挥有重要作用。共同拥有四个相同氨基酸替换的突变子(48-6、32-2、7-10)的获得也表明这四个氨基酸位点(M315、H399、N429、V466)也是十分重要的。通过对以6个同源蛋白为模板建立的三维模型的分析及配体位置及结合位点的预测，发现AtzA具有氨基水解酶家族典型的(β/α)8结构域及一个双β-sheet结构域。本研究确定了铁离子的空间位置及与之结合的五个氨基酸位点，指出与配体及底物结合的位点位于(β/α)8结构域中由8个β-strand组成的桶状核心内。此外，本研究通过分析突变位点的三维结构分布，认为临近(β/α)8结构域的β-sheet内的突变显著影响酶活性，这种影响可能是由于其整体结构稳定性的改变所致。本项目还开展了atzA转植物研究、作为遗传标记基因的微藻转基因体系研究、外源基因表达的包涵体消融机理研究及AtzA关键位点的点饱和突变研究。项目实施过程中，共培养硕士生6名、博士生4名，发表论文6篇，另有1篇论文正在投稿、1篇论文正在整理，超额完成了预期考核指标。