杜氏盐藻Ds-26-16的功能及广谱耐盐分子机制的研究

Dunaliella salina (Dunal) Teod is a unicellular eukaryotic green alga, not only highly salt-tolerant, but also has super adjust capability to drastic change in salt concentration. Previously we have identified 5 novel salt-tolerance cDNAs, which are completely different from the existing sequences in GenBank, from a salt stress induced D. salina cDNA library. Among them, Ds-26-16 contains a sole open reading frame and the encoded 6.1 kDa protein is localized in nucleus. The gene transformation could confer salt tolerance to diverse organisms including prokaryote and eukaryote, suggesting that it is possibly a broad-spectrum salt tolerance trans-regulatory gene. However, what is the mechanism that Ds-26-16 gets involved in salt stress response in different kinds of organisms? What is the difference in the salt stress signal pathway among different kinds of organisms? Therefore, the current research will first generate different transgenic organisms including Escherichia coli, yeast, Chlamydomonas reinhardti, Arabidopsis thaliana that over-expressing Ds-26-16, then to analyze the functional characterization, intervene mechanism and signal transduction pathway by combining the molecular biology with genetic technology, to elucidate the changes of salt stress responses, molecular intervene mechanism and salt stress signal pathways in different kinds of organisms, then compare them in different kinds of organisms and elucidate the molecular mechanism to confer broad-spectrum salt tolerance. The research is of great significance owing to theoretically enriching the current salt stress regulation theory and practically promoting the wide application of broad-spectrum salt tolerance gene.

杜氏盐藻不仅极端耐盐，而且对外界盐浓度的剧烈变化有超强的渗透调节能力。前期，我们从其盐胁迫cDNA文库中筛选出5个与GenBank发表序列完全不同的新基因，其中Ds-26-16编码的小蛋白定位于细胞核中，转入包括原核和真核生物在内的多种生物，均能显著提高受体生物的耐盐性，可能是一种广谱型的盐胁迫反式调控基因。那么，Ds-26-16是通过何种机制介入不同类型生物盐胁迫反应的？其介导的盐胁迫信号通路在不同类型生物之间有何异同？为此，本项目拟以过表达该基因的不同类型生物（大肠杆菌、酵母、莱茵衣藻、拟南芥）为材料，围绕其功能属性、介入机制和信号通路三个方面，通过分子生物学和遗传学技术，分别阐明其在不同受体生物中的胁迫反应变化、分子互作机制及盐胁迫信号通路，再通过不同类型生物的比较，揭示Ds-26-16广谱耐盐分子机制。该研究理论上将丰富盐胁迫调控理论，实践上将为其广泛应用奠定基础。

土壤盐渍化是影响生物生长与分布的关键因素之一，寻找和鉴定新的耐盐基因、阐明其分子机制，对于盐渍化土壤改良与利用具有重要意义。前期，我们从盐胁迫杜氏盐藻cDNA文库中筛选出5个与发表序列完全不同的新基因，其中Ds-26-16编码的小蛋白定位于细胞核中，转入包括原核和真核生物在内的多种生物均能显著提高其耐盐性，本项目以此为对象，围绕其功能属性、介入机制、信号通路三方面深入开展研究。经过4年研究，取得了以下几方面成果：通过定向进化获得了7个耐盐性显著提高的进化基因，其中S32A突变导致其N端和C端的α-螺旋由原来的垂直状态变成反向平行状态，使其最高耐盐度从Ds-26-16的1.03 M提高到EP-5的1.54 M。过表达株分析显示，Ds-26-16和EP-5显著提高大肠杆菌、莱茵衣藻、水稻、拟南芥和烟草耐盐性，但不能提高毕赤酵母和酿酒酵母耐盐性，表明其耐盐性提高有物种选择性。水稻耐盐性分析显示，其耐盐性提高为ABA非依赖型。除赋予耐盐性外，Ds-26-16和EP-5还赋予受体细胞抗反复冻融、低温、高温、Cu2+、碱胁迫能力，其机制是促进细胞稳定、提高CAT和POD活性、降低MDA水平、刺激NO合成。进一步研究发现，Ds-26-16和EP-5是通过降低细胞内的pH值、上调硝酸还原酶活性来增加细胞的NO含量。iTRAQ分析表明，其过表达导致大肠杆菌202个蛋白呈现差异表达，推测其是从渗透平衡、能量代谢、氧化应激保护等方面全局性调控受体细胞胁迫响应。上述成果丰富了盐胁迫调控理论，也为其广泛应用奠定了理论基础。项目共发表标注基金号的SCI期刊论文9篇，培养研究生10人，获得耐盐工程株系10余个，无偿转让基因给国内科研单位开展研究1次。