阿特拉津对非洲爪蟾发育影响的分子毒理学研究

三嗪除草剂阿特拉津对环境生物有着巨大的生态危害，已被疑为引起两栖类大量减少的重要环境因素，且对人类健康也存在着潜在的危害性。阿特拉津对两栖类表现出的雌激素效应，及其诱导生物产生发育毒性的分子机制尚不清楚。我们曾经以鱼类为模型动物，发现阿特拉津能够引起青鳉鱼形态学和部分发育相关基因的表达变化。基于两栖动物的生存现状和生活环境的特殊性，在前期工作的基础上，本课题拟利用基因芯片对两栖类非洲爪蟾发育相关基因进行筛选，寻找敏感基因，然后运用Real time RT-PCR、原位杂交和western blot对敏感基因的基因表达和蛋白表达进行验证，确定阿特拉津毒性作用的敏感基因和信号传导途径，最终从分子水平上阐述阿特拉津对非洲爪蟾产生发育影响的分子毒理学机制。

本次实验设0.05%DMSO阴性对照组和4个阿特拉津染毒组，分别是0.1、1、10和100 µg/L组，每个剂量组随机挑选90只蝌蚪，分三个组，每组各30只，设 4个25 cm×20 cm×20 cm的平行缸。在非洲爪蟾暴露3个月时第一组取性腺进行组织病理学检测，观察阿特拉津对非洲爪蟾性腺的发育毒性，包括形态发育、性腺组织中卵母细胞、卵泡、精母细胞、精子细胞和输精导管等各类细胞形态结构的毒副作用。同时，取非洲爪蟾的性腺和肝脏组织，进行称重和基本形态观察。暴露6个月时取性腺组织，运用非洲爪蟾全基因组表达谱芯片和Real time RT-PCR技术，对性腺组织进行敏感基因和细胞信号通路的筛选；暴露12个月时对肝脏组织进行相关基因表达研究。.1.阿特拉津对非洲爪蟾一般生长发育情况的影响.阿特拉津暴露组中非洲爪蟾的死亡率与对照组相比无明显差异，体重、体长差异不显著。阿特拉津引起非洲爪蟾肝脏系数的升高，0.1、100µg/L阿特拉津暴露组中，幼蛙的脂肪体出现黄色小斑点、体积小、粘连甚至退化的现象，一定程度上延缓了性腺发育。0.1和100µg/L暴露组蝌蚪完成变态所用时间长于对照组，呈现“U”字型，阿特拉津在一定程度上抑制了蝌蚪的变态。1µg/L阿特拉津暴露组中雄性性腺出现异常节段，1和10µg/L暴露组增加了雌性爪蟾的比例。.2. 阿特拉津对非洲爪蟾性腺组织学的影响.阿特拉津导致睾丸组织结构变得疏松，组织内出现类似于卵巢组织的空隙；睾丸发育迟缓，组织内充满初级精原细胞和次级精原细胞，缺少精子；睾丸组织内生殖细胞数量明显减少，甚至出现萎缩，引起雄性性腺组织学发生雌性化改变和退行性变化。.3.阿特拉津对雄性非洲爪蟾性腺敏感基因和细胞信号通路的筛选.通过GO分析，在分子功能、生物过程和细胞组成三个部分获得了差异基因聚集的多条功能条目。通过Pathway分析，我们得到了6条差异显著的细胞信号通路，分别是精氨酸和脯氨酸能量代谢通路、细胞周期通路、剪接体通路、碱基切除修复通路、核黄素代谢通路和孕酮介导的卵母细胞成熟通路。.4.阿特拉津对非洲爪蟾肝脏相关基因表达的影响.阿特拉津使100µg/L组雄性非洲爪蟾的AR水平显著增高(p<0.05)，使100µg/L组非洲爪蟾HSP90表达水平显著升高(p<0.05)，而对VTG、ER、HSP70和GR的表达水平无显著性影响。