牛珀至宝微丸通过HMGB1调控髓源性抑制细胞防治感染性休克

Early inflammatory cascade and late immunosuppression are the key scientific problems of septic shock. MDSCs is the main effect cell of immunosuppression. HMGB1 affects the differentiation and immunosuppressive function of MDSCs. Niupozhibao Pellet can not only block the inflammatory cascade via HMGB1 location in nucleus and binding-NF-κB, but also inhibit the immunoreprssion via HMGB1-PPARγ-binding induced MDSCs apoptosis. This project utilizes the in vitro biochemical technology to investigate that Niupozhibao Pellet stop the inflammatory response by blocking the HMGB1 and NF-κB; and utilizes flow cytometry, high content Imaging and mRFP-eGFP-LC3 to investigate that HMGB1 acts the molecular mechanism of autophagy and apoptosis, proliferation and differentiation of MDSCs in Tet-on-HMGB1 over-expression and point-mutation of RAW264.7 cells and conditional ablation of HMGB1 of myeloid cells; and then, utilizes conditional ablation of HMGB1 mice to replicate cecal ligation and puncture (CLP) model, to investigate effect, optimal combination of effective components, and to explore the prescription dose and treatment time window. This project will further study the scientific connotation and molecular mechanism of clearing-heat and detoxicating theory of traditional Chinese medicine to regulate immunologic homeostasis, so as to provide theoretical basis for clinical emergency of Chinese medicine.

早期的炎症级联反应和晚期的免疫抑制是感染性休克面临的关键科学问题。MDSCs是免疫抑制的主要效应细胞，HMGB1影响MDSCs的分化和免疫抑制功能，牛珀至宝微丸可能通过HMGB1与NF-κB结合实现炎症级联反应的“刹车”，与PPARγ结合促进MDSCs凋亡，通过“变道”调节免疫平衡。本项目利用体外生化技术研究牛珀至宝微丸对HMGB1与NF-κB结合阻断炎症级联反应的刹车机制，采用流式细胞和高内涵成像、双荧光mRFP-eGFP-LC3自噬指示体系等技术用HMGB1过表达、点突变RAW264.7细胞和条件性敲除的小鼠骨髓细胞研究HMGB1对MDSCs增殖、分化、自噬和凋亡的分子机制，再用髓系HMGB1条件性敲除小鼠复制盲肠结扎穿孔术（CLP）动物模型检测药效作用，优化组合有效成分，探索组方剂量和治疗时间窗。本项目深入研究中医清热解毒理论调理免疫功能的科学内涵和分子机制，为中医临床提供科学依据。

防治感染性休克面临的关键科学问题是如何调控宿主免疫反应在早期的过度激活及晚期的过度抑制。MDSCs是免疫抑制的主要效应细胞，HMGB1影响MDSCs的产生、分化与免疫抑制功能。本项目通过生物信息学技术分析，提出HMGB1存在与关键炎症因子IL1β、TNFα、IL10、TGFβ等均存在直接结合靶点，为“急刹车”机制提供了理论依据；通过体外生化技术，验证了HMGB1与NF-κB/PPARγ可通过共结合阻断炎症级联反应的“缓刹车”机制。通过用HMGB1过表达、点突变、敲除RAW264.7细胞，研究了HMGB1对单核、巨噬细胞免疫反应功能调控的分子机制，结果表明，核内HMGB1高表达时细胞对LPS刺激耐受，而当敲除HMGB1后，该细胞更容易受到刺激，免疫反应更强；进一步用造血系条件性敲除的小鼠及其骨髓细胞研究了HMGB1对MDSCs生成、分化的影响，动物实验结果表明敲除HMGB1后的小鼠生成更少的MDSCs，免疫反应更强，体外实验结果表明敲除HMGB1后的骨髓细胞产生更少的MDSCs。用野生型小鼠复制盲肠结扎穿孔术（CLP）动物模型后，通过GR-1抗体清除小鼠体内MDSCs，结果发现清除MDSCs后动物早期发生大量死亡，提示MDSCs对感染性休克动物早期的保护作用；再通过MDSCs回输实验，验证MDSCs的保护作用；最后使用造血系HMGB1条件性敲除小鼠复制CLP模型，结果表明，体内敲除HMGB1后MDSCs的生成减少及免疫反应更强。最后用牛珀至宝微丸有效成分丹皮酚探索了对CLP模型的干预剂量和治疗时间窗。本项目深入研究中医清热解毒理论调理免疫功能的科学内涵和分子机制，为中医临床提供科学依据。