牛珀至宝微丸调控过氧化物酶体增殖物激活受体γ的核内共阻遏机制

This project supposes that Niupo Zhibao Pellet regulate HDAC3/NF-κB/PPARγ via a synergistic suppression mechanism based on the results of our investigation. The results suggested that Niupo Zhibao Pellet enhanced histone deacetylases (HDACs) and inhibited histone acetyltransferases (HATs), upregulated significantly Peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPARγ) to 18.77 folds, suggesting that PPARγ should be the key, HDAC3 be the switch and NF-κB be the target in the synergistic suppression mechanism. The project constructs CD36/iNOS Luciferase report genes combination with siRNA silencing to scan active ingredients of Niupo Zhibao Pellet and co-repressionors. Transcription factors and DNA promoters' complex combinded with PPARγ/HDAC3/NF-κB co-repression are detected with GST-pull down and Chip-on-chip method. Therapeutical effect of active ingredients of Niupo Zhibao Pellet in Vivo on endotoxin shock should be proved by three animal experimental testing with C57 mice, NF-κB transgene mice and PPRE transgene mice.

前期研究利用基因芯片技术发现牛珀至宝微丸上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）达18.77倍，还上调共阻遏因子去组蛋白乙酰基酶（HDACs）而抑制共激活因子组蛋白乙酰转移酶，推测牛珀至宝微丸以PPARγ为核心募集HDAC3等共阻遏因子抑制NF-κB转录。本项目构建靶基因CD36/iNOS双荧光素酶报告基因，结合siRNA技术研究PPARγ共阻遏因子和筛选牛珀至宝微丸活性成分；以siRNA抑制和基因转染过表达作对照，以牛珀至宝微丸及其活性成分大黄素、β-细辛醚、丹皮酚的配伍干预，以GST-pull down和Chip-on-chip技术研究PPARγ共阻遏因子及靶基因启动子；再以NF-κB和PPARγ转基因小鼠在体实验验证。牛珀至宝微丸及其活性成分调控核内共阻遏机制不同于HDAC抑制剂和PPARγ激动剂等单一靶点药物，对突破单靶点药物治疗感染性疾病的局限性有重要的现实意义和科学价值。

本项目基本按照调整后的研究计划完成。以野生型、HMGB1过表达型、HMGB1点突变型三个细胞模型和内毒素休克大鼠模型，以PPARγ激动剂罗格列酮和抑制剂GW9662干预，研究了PPARγ/HMGB1/NF-κB表达、活性和结合，发现牛珀至宝微丸（以下简称牛丸）有效成分大黄素、丹皮酚等能抑制HMGB1基因表达，抑制HMGB1分泌出胞，降低内毒素休克动物致死率；发现牛丸有效成分大黄素、丹皮酚等有PPARγ激活样作用，促进PPARγ表达，促进PPARγ与HMGB1、NF-κB等转录因子结合，抑制NF-κB转录活性，减少炎症因子转录；牛丸有效成分大黄素、丹皮酚等还可以调控LPS刺激的炎症相关的MicroRNA表达，大黄素、丹皮酚通过协同的方式调控相同的MicroRNA，通过互补的方式调控不同的MicroRNA，提示在配合使用时可能产生更好的作用效果。大黄素、丹皮酚可能是中药复方牛丸的主要药效成分，能调控HMGB1、PPARγ的表达，以及与HDAC3、NF-κB的结合和相互作用，通过共阻遏机制抑制炎症因子转录或者MicroRNA活性产生抗炎作用。HMGB1可能是牛丸治疗内毒素休克晚期的药理靶标，PPARγ核内共阻遏机制可能是牛丸治疗内毒素休克晚期的分子药理机制。本项目还发现大黄素、丹皮酚能反向调控LPS诱导的MicroRNA表达；核内高表达的HMGB1也能抑制MicroRNA表达，点突变后HMGB1对MicroRNA的抑制作用更显著，提示HMGB1可能选择性地结合DNA抑制MicroRNA表达，从而抑制炎症。.综上所述，本项目研究发现，牛丸有效成分大黄素、丹皮酚存在三个抗炎机制，一是通过增强HMGB1在胞核内的高表达减少HMGB1分泌出胞直接抑制炎症反应加剧；二是通过增强PPARγ的表达和促进HMGB1、HDAC3与NF-κB的相互作用通过共阻遏机制抑制炎症反应；三是通过抑制MicroRNA表达产生抗炎作用。其中，PPARγ和HMGB1在核内的相互作用可以调控NF-κB的活性影响炎症因子的产生，也可以调控MicroRNA表达产生抗炎作用，可能是影响炎症反应的关键机制。.本项目深入研究了牛丸有效成分调控PPARγ、HMGB1和MicroRNA作用的有效成分及其作用机制，达到了预期研究目标。本项目共发表论文6篇，其中SCI论文3篇，申请专利1项，培养研究生5名，取得了预期成果。