盐藻以烯醇酶为核心元件的甘油代谢调控模式及代谢优势研究

研究表明，盐藻通过快速合成甘油平衡外界高渗透压。甘油的产生除通过糖酵解途径降解淀粉，还存在补偿途径，即光合作用固定的碳通过糖异生生成甘油。烯醇酶对光合作用固定的碳具分流作用，它的催化产物PEP对糖酵解途径关键酶PSK具有变构调节作用。那么，在高渗胁迫下，盐藻烯醇酶是否可以通过对PEP生成量的调节实现对甘油代谢的调控呢？我们将通过对烯醇酶及相关组件在转录、表达及酶活三个层面变化的分析，以及效应物PEP和甘油生成量的动态监控，来回答这个问题。同时盐藻烯醇酶的叶绿体定位不同于普通高等植物，提示我们：光合作用、糖酵解/异生途径以及甘油代谢这三条途径可能存在某种空间偶联，为共同参与甘油合成形成区隔化优势。我们拟分离叶绿体作酶活性分析，确定这三条途径的相互作用关系；并对烯醇酶相关组件进行细胞定位和蛋白质插入分析，探索酶系作用的代谢优势。为进一步揭示盐藻的独特调渗机制提供证据。

本项目通过对盐藻在高渗胁迫下甘油合成及糖酵解途径关键酶在转录、表达及酶活三个层面变化的分析，以及烯醇酶效应物PEP和甘油生成量的动态监控，揭示了在高渗胁迫下糖酵解途径与甘油代谢的关系。结果显示：盐藻在高渗胁迫下，首先通过糖酵解途径下游烯醇酶基因的低表达及酶活的降低一方面能够减少光合作用固定的碳进入三羧酸循环；另一方面可以减少PEP生成量，弱化PEP对上游关键基因PFK的反馈抑制作用，促进果糖-6-磷酸和ATP向果糖-1,6-二磷酸的转化，推动甘油合成前体DHAP的生成，提高细胞内甘油合成速率，平衡外界高渗环境。.另外，克隆了甘油合成及糖酵解途径关键酶基因，构建原核表达载体、诱导重组蛋白表达及纯化、制备多克隆抗体。通过激光共聚焦显微镜对荧光标记抗体进行细胞定位，初步认为以上关键酶与叶绿体纯在共定位。同时我们还通过选择最适NaCl 浓度、培养过程中持续通入CO2、分离过程中保持等渗透压的外界环境等方式优化了盐藻叶绿体的提取方法。并提取叶绿体总蛋白进行westren blot，结果也显示了以上蛋白的叶绿体定位。验证了盐藻细胞中光合作用、糖酵解途径以及甘油代谢这三条途径存在某种空间偶联，为共同参与甘油合成形成区隔化优势，为进一步揭示盐藻的独特调渗机制提供证据。