MtB亚单位蛋白微粒抗原的高效植物病毒载体表达系统的研究

Tuberculosis (TB) is caused by an infection of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and remains an enormous and increasing health burden worldwide. To date, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) is the only licensed anti-TB vaccine worldwide, which provides an important but limited protection fromthe Mtb infection. The development of alternative anti-TB vaccines is therefore urgently needed. The have gained increasing attention in anti-TB vaccine development. In an effort to develop effective recombinant subunit vaccines for TB prevention, approaches to high-level heterologous protein production and an immunogen-specific adjuvant for a recombinant subunit vaccine are essential. A system based on version of cowpea mosaic virus, which overcomes limitations on insert size, provides a quick, easy, and inexpensive eukaryotic expression system for the production of large quantities of recombinant proteins. And Zera tags allowed its recombinant fusion antigens to form fully active protein microparticles and were identified as good vaccine carriers or immunogen-specific adjuvants. Consequently，in order to solve the key problems in the prevention of Tuberculosis, the advantages of Zera tags and CPMV vectors will be combined together and a novel technology named CPMV plus Zera will be established. To test their potential as TB vaccine carriers, the immunogenicity of Zera induced microparticles will be examined by assessing the antigen-specific immune responses in a mice model. The strategy of microparticles-like TB antigens superproduction in a plant might be used as a basis for the creation of prophylactic and therapeutic vaccine against TB.

结核病是由结核分枝杆菌引起的、严重威胁人类生命健康的传染性疾病。卡介苗是当前唯一被批准用于人体免疫的结核病疫苗，但其免疫预防效果不甚理想，迫切需要新型的抗结核疫苗。重组亚单位蛋白疫苗是抗结核新疫苗研发的重要疫苗类型，高效的表达系统和合理的佐剂方案是推动该研究领域发展的助力。研究表明，新型豇豆花叶病毒植物病毒表达载体具有表达量高和不受外源基因片段大小限制等特点；而Zera标签融合抗原形成的蛋白质微粒是一种优良的疫苗载体/佐剂。项目拟结合这两种技术的优势，建立CPMV plus Zera新型植物病毒表达系统；探明该技术在植物中表达抗结核微粒抗原的可行性和特性；建立与之相对应的简易重组产物纯化技术；明确Zera融合蛋白质微粒作为疫苗载体/佐剂在亚单位疫苗应用中的可行性和潜能。研究结果可为新型抗结核亚单位蛋白疫苗的研究提供助力，并为其它威胁人类的重大传染性疾病疫苗的研发提供一种可供选择的思路。

结核病是由结核分枝杆菌引起的、严重威胁人类生命健康的传染性疾病。卡介苗作为当前唯一被批准的结核病疫苗免疫预防效果不甚理想，迫切需要新型的抗结核疫苗。重组亚单位蛋白疫苗是抗结核新疫苗研发的重要疫苗类型，高效的表达系统和合理的佐剂方案是推动该研究领域发展的助力。Zera标签融合抗原形成的蛋白质微粒是一种优良的疫苗载体/佐剂，新型豇豆花叶病毒植物病毒表达载体具有表达量高和不受外源基因片段大小限制等特点。项目以结核分枝杆菌优势抗原CFP-10等为研究材料，结合CPMV病毒载体和Zera标签的特点与潜能，构建了表达结核分枝杆菌抗原的系列CPMV plus Zera植物病毒表达载体，以农杆菌渗滤技术接种受体烟草植物Nicotiana excelsiana，对Zera 标签融合蛋白微粒在植物中的表达情况和表达产物的特点进行了观察和分析，结果显示Zera-CFP10、Zera-ESAT6及Zera-Ag85B表达载体在接种后第3天可以检测到目标蛋白，接种后第7~9天后保持稳定且产物完整。观察烟草叶片细胞中蛋白微粒的形态特征发现，叶片细胞中的微粒团块是由大小不均一、边缘轮廓清晰的近圆形小球组成。小球微粒直径范围为0.5~2.5 μm之间。从Zera 标签形成微粒的粒径大小、表面形态、均匀程度和抗原含量等因素分析，认为表达的微粒具有成为亚单位疫苗生物载体的潜力。采用蔗糖密度梯度离心和垫层离心对Zera-GFP微粒进行了纯化，实验结果显示60%蔗糖垫层相对更适合作为Zera 标签蛋白微粒的初步纯化技术。以纯化的CFP10可溶性蛋白为对照，对Zera-CFP10微粒抗原进行了免疫学评价实验，结果显示CFP10和Zera-CFP10均能刺激小鼠产生较强的体液免疫应答，且微粒抗原产生的免疫反应高于可溶性抗原。所有处理组中小鼠CD4+和CD8+细胞占总淋巴细胞的比例显著高于PBS对照组，认为Zera标签形成的微粒具有成为疫苗生物载体的潜力。相关研究成果对推进新型抗结核亚单位蛋白疫苗的研究提供了新的可供选择的研究思路。