基于体内化学物质信息研究中药杜仲雌激素样功效物质

Ecommia ulmoides Oliv is a well-known medicinal plant in traditional Chinese Medicine. It has been served as one of the oldest tonic herbs in strengthening tendons, bones and muscle, benefitting liver and kidney and so on. Many studies showed that Ecommia ulmoides Oliv have estrogen-like activity, however the effective components in vivo are still not very clear. In our previous research, we had indicated that pinoresinol di-O-β-D-glucopyranoside, a major ingredient of E. ulmoides has poor oral bioavailability, and its metabolite was also detected. So we proposed that the metabolites of E. ulmoides extract would play estrogen-like activity in vivo. To study the effective components in vivo, the metabolism of the extract in rats would be investigated. On the one hand, the components absorbed in blood were definited via analyzing the compounds both in vivo and in vitro. On the other hand, the metabolites are isolated from the biosample by means of macroporous adsorptive resin chromatography, silica gel column chromatography, Sephadex LH-20 column chromatography, and preparative high-performance liquid chromatography for the first time, and their structures are identified using Q-TOF-MS and NMR spectra. Meanwhile, the cell proliferation and ER subcellular localisation analyses of the components absorbed in blood should be investigated to proclaim whether the metabolites or the constituents are responsible for its in vivo pharmacological effects. This study would provide thought and reference for the modernization of traditional Chinese medicine.

现代药理研究表明杜仲补肾阳、强筋骨的功效与雌激素样活性密切相关，但有关其在体内发挥作用的药效物质是杜仲含有的化学成分还是其代谢产物，目前尚不十分清楚。课题组前期研究发现杜仲主要化学成分松脂醇二葡萄糖苷在体内血药浓度较低，并监测到其相关代谢产物，由此我们提出如下假说：杜仲的相关药效物质与体内代谢产物有关。本课题基于中药整体观研究思路，通过比较杜仲提取物与口服给药后入血成分分析，明确杜仲提取物入血成分的存在形式，并从易于富集的排泄物（尿液、粪便、胆汁等）入手，采用现代色谱分离技术分离、制备杜仲提取物在大鼠体内代谢产物，进而以MCF-7细胞增殖实验和报告基因转录激活实验为研究模型评价提取物入血化学成分的活性，明确体内雌激素样活性的存在形式，进而根据体内生物转化规律揭示杜仲中的药效物质形式。本课题从口服中药的体内活性形式出发阐明杜仲的雌激素样作用物质，将为传统中药的现代研究提供新的思路和参考。

杜仲为杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)的干燥树皮，《神农本草经》和《本草纲目》都将其列为上品，临床上用于治疗肾虚腰疼、胎动胎漏、高血压等，杜仲叶为杜仲的干燥叶，同样具有补肝肾、强筋骨的功效，自2005版《中华人民共和国药典》开始，被正式列入其中。化学成分和药理活性研究发现，二者比较相似，现代药理研究表明杜仲和杜仲叶补肾阳、强筋骨的功效与雌激素样活性密切相关，但有关其在体内发挥作用的药效物质是其本身含有的化学成分还是其代谢产物，目前尚不是十分清楚。本课题基于中药整体观研究思路，采用现代色谱分离技术对杜仲和杜仲叶化学成分进行系统研究，采用多种现代分离手段共分离得到200余种化学成分，根据其理化性质和波谱、光谱数据鉴定了它们的化学结构，为进一步深入的体内代谢研究和活性评价提供了物质保障；松脂醇二葡萄糖苷（木脂素类）是中药杜仲的主要有效成分之一，2015版《中华人民共和国药典》中明确规定其在杜仲中的含量不得少于0.10%，从大鼠灌胃给予松脂醇二葡萄糖苷后收集的排泄物（尿液、粪便、胆汁等）入手，采用现代色谱分离技术从中分离、制备五种代谢产物；结合文献报道和对照品信息，利用UPLC-Q-Tof/MS技术系统分析鉴定了其在大鼠体内的代谢形式，共鉴定了31种相关代谢产物；并对其在大鼠体内的代谢途径进行了推测；同时从大鼠灌胃杜仲水提物后收集的排泄物中分离制备了28种体内代谢产物，在此基础上，结合文献报道和标准品的色谱行为、质谱裂解规律，利用UPLC-Q-Tof/MS技术系统分析鉴定了杜仲提取物在大鼠体内的代谢产物，共鉴定了60种代谢产物，从而明确其在体内的存在形式；采用计算机分子对接虚拟筛选技术，将分离得到的化学成分和体内代谢产物200余种与雌激素样活性相关的蛋白进行对接，筛选出可能的雌激素样物质，进一步以MCF-7细胞增殖实验进行验证，评价了28种三萜类成分的细胞增殖活性，LDH实验证实27号单体化合物对细胞损伤程度没有明显的差别，CCK-8实验得出其对MCF-7细胞增殖有较好的效果，说明其具有潜在的雌激素样作用。本课题从口服中药的体内存在形式出发阐明杜仲的雌激素样作用物质，为传统中药的现代研究提供新的思路和参考，同时为中药创新药物分子的发现开辟新的途径。