基于连续培养的体内核酶筛选体系

As a new molecular tool, ribozyme and DNAzyme are functional nucleic acid sequences with catalytic ability, which have been applied in medical diagnosis, nano technology, genetic therapy and so on. Most of those catalytic nucleic acids were obtained through in vitro selection, which is time-consuming and tedious. Moreover, the DNAzyme obtained from in vitro selection reveals different catalytic ability when applied in vivo. This project is proposed to develop a new in vivo selection technique based on continuous cultivation of bacteria to obtain the DNAzyme in short period of time, which could effectively work in vivo directly. The RNA-cleaving DNAzyme will be selected through this method. To get the high efficient DNAzyme for the future application of genetic manipulation and therapy in vivo, the cleaving reaction will be carried out in the intermolecular way, and the antibiotic resistance in the process of continuous cultivation of bacteria is the pressure of evolution.

核酶是具有催化功能的核酸分子，作为一个全新的分子工具，核酶在生物分析、医学诊断、纳米技术以及基因治疗等方面发挥着越来越大的作用；由于绝大多少核酶通过体外筛选获得，而体外筛选过程冗长而繁琐，而且通过体外筛选获得的核酶在体内的表现会出现较大的差异。本项目拟发展新的基于细菌为载体的体内核酶筛选进化体系，以期快速获取能够直接在体内工作核酶；以筛选能够在细胞内高效剪切目的mRNA的脱氧核酶为目标，分子间的反应为核酶工作方式，抗生素抗性为进化压力，通过细菌的连续培养驱动核酶的进化，最终获得催化能力更为高效的全新核酶，为体内基因的调控和疾病治疗提供更强大的分子工具。

核酶是具有催化功能的核酸分子，作为一个全新的分子工具，核酶在生物分析、医学诊断以及基因治疗等方面发挥着越来越大的作用。然而，由于绝大多数核酶通过体外筛选获得，不仅筛选过程冗长而繁琐，且获得的核酶在体内的活性通常会明显降低甚至丧失。因此，建立科学的体内筛选技术对于获得能够在体内高效工作的核酶具有重要意义。本项目以核酶基因文库、毒性蛋白（IbsC）信号报告基因为核心元件构建重组质粒筛选文库，转录的核酶可调控毒性蛋白的表达从而影响菌体存亡，平板筛选存活大肠杆菌即可获得活性核酶。该方法简单、经济、快速，可作为一种通用的核酶体内筛选方法。基于该方法，成功获得新型锤头型核酶TX-2、TX-5、T-X9、HHRzG。其中，TX-2无论在原核还是在真核细胞内都表现出比野生型锤头核酶更好的基因敲降效果。我们还建立了新的锤头型核酶剪切位点序列规则，为锤头型核酶的应用提供了更为准确的应用指导。在体内筛选工作方面，还开展了两项主要研究工作：（1）妥布霉素适配体体内筛选和全细胞传感器的建立；（2）腔肠素酶筛选方法的构建及功能进化。前者提供了成熟、可通用的适配体体内筛选方法，获得了可在体内工作的妥布霉素新适配体TR9、TR22和BR38，以此建立的全细胞传感器在复杂样本牛奶、血清、尿液中也可有效工作。后者提供了较传统方法更省时省力的新的腔肠素酶筛选方法——快速文库缩小法，得到了新的腔肠素酶突变体M43IL119Q，发光稳定性、强度及在尿液、血清、Hela细胞等复杂样本中的活性均优于野生型及现有突变体。此外，在本项目经费支持下，还开展了新型抗癌靶点和药物的发现及确证研究、核酸检测新技术的方法学及应用研究、新型蛋白显影工具的发现及应用研究，为基因治疗、核酸检测和生物分析提供了有价值的技术储备和应用指导。至此，在本项目经费支持下，发表SCI论文14篇，申请发明专利8项（2项已获授权）。