PCR比色核酸探针在病原诊断中的应用

探索酶催化扩增和比色探针结合进行基因扩增和检测的新方法，替代现有的荧光探针为主的基因检测方法。将具有类似过氧化物酶活性核酶应用于PCR比色探针设计中，结合DNA聚合酶的5'-3'外切酶活性进行基因检测策略设计，在PCR扩增过程中特性性地对探针进行剪切，引发随后的核酶扩增和显色反应实现DNA病原的比色检测；通过引入具有逆转录活性的DNA聚合酶 Taq M1一步法对RNA的扩增，和比色探针检测方法联用便实现对RNA病原进行检测；采用3+1的非对称核酶分解方式将核酶引入比色探针，应用于单核苷酸多态性SNP的PCR-LDR检测中，依靠DNA链接酶对碱基错配的高灵敏度实现特性的链接反应，从而引发随后的核酶扩增和显色反应达到对SNP的检测。通过本项目的研究，建立起针对DNA、RNA和SNP病原比色检检测方法。用更加高效、准确和价廉的基因比色检测方法，提高医学检测效率，降低医疗检测成本。

现有以荧光探针为主的基因检测方法因探针合成成本高、检测仪器昂贵等因素严重影响了相关技术和产品的推广和普及，本项目针对这一现状，旨在探索基于核酶的比色核酸探针技术进行基因扩增和检测的新方法，相继开展了以下几方面研究工作：.1. 基于核酶的PCR比色核酸探针技术的研究.该技术将基于核酶的比色探针与DNA 聚合酶的 5'-3'外切酶活性相结合，使得比色探针在PCR过程中被不断剪切产生大量核酶，从而催化比色反应进行以实现DNA的比色检测。通过引入兼具逆转录活性的DNA聚合酶Taq M1，便可实现对RNA 的一步法扩增。这两个技术已成功应用于嗜水气单胞菌、乙肝病毒、艾滋病毒、转基因水稻和棉花等的比色检测。.2. 基于核酶的等温比色核酸探针技术.由于基于PCR的检测技术需要反复热循环，操作复杂且具有仪器依赖性，为了克服这一弊端，我们开展了等温比色核酸探针技术的研究，共建立了两种等温比色核酸探针体系。一是结合核酶和杂化链式反应的等温扩增技术，并进一步建立了可视芯片技术，可以实现中等通量的快速比色检测；二是结合具有定点RNA内切酶活性的核酶以及等温链置换技术建立的RNA等温扩增技术，在引入小分子适配体后，还实现了葡萄糖胺-6-磷酸的比色检测。.3. 基于脱氧核酶的基因突变比色核酸探针技术.我们首先通过核酶与连接酶链式反应相结合建立了基因突变比色核酸探针技术，成功实现了镰刀性贫血基因以及遗传性耳聋基因GJB2的检测，并能够准确进行杂合子和纯合子的区分。此外，将RNA引物的高特异性延伸能力和等位基因扩增技术相结合，也能实现对单碱基突变的进行高度区分。.4. 基于核酶的比色核酸探针技术在中成药质量控制中的应用.为了弥补化学分析方法难以对中药进行准确的源性检测，我们开展了一系列基于基因检测技术的中药质量控制技术的研究，不仅实现了简单中药材的检测，还能对成分复杂且经过多重加工的包括片剂、散剂、注射液、口服液各种剂型的中成药中的药材成分进行准确鉴定。.5. 体外筛选功能性大分子的研究.建立了较为完善的功能核酸体外筛选平台，成功获得了能够剪DNA的脱氧核酶、可光敏剪切RNA的功能性DNA单元、可模拟GFP发光的RNA适配体。此外，还完成了基于DNA展示技术进行体外活性多肽筛选的平台建设。