三氧化二砷联合粉防己碱对三阴乳腺癌细胞株及干细胞微球体调控作用的研究

It is difficult to treat triple-negative breast cancer. Breast cancer stem cells may be the real cause of the origin of tumor recurrence and metastasis. Cultivation of microspheres in breast cancer stem cells is one of the most effective method to study on triple-negative breast cancer. Research group considered the main disease mechanism of breast cancer is “phlegm-toxin” from clinical practice. Breast cancer stem cells may belong to “phlegm-toxin” in TCM. It has been confirmed in our study at early phase that arsenic trioxide combined tetrandrine can produce obvious synergistic effects. Further study the effect of the two drugs to tumor microenvironment and lung metastatic, foreground is considerable. Based on the above achievements, we will use mammosphere culture method to administer the two drugs into triple negative breast cancer. Observe the adjusting effects on microsphere cells, and differential expression of stem cell markers CD44 CD24, etc; Study on the drugs regulation of stem cells signal pathway and related gene; Further study their effect on telomerase activity of stem cells. By this topic research, mading new breakthroughs in TCM treatments against triple negative breast cancer.

三阴乳腺癌作为临床治疗难点，乳腺癌干细胞可能是其起源、复发与转移的真正原因，干细胞微球体培养方法是目前研究三阴乳腺癌最有效的手段之一。本课题组根据临床实践认为“痰毒”为乳腺癌主要病因病机，乳腺癌干细胞可能属于中医“痰毒”范畴。前期系列研究发现中药组分三氧化二砷与粉防己碱联合用药治疗乳腺癌具有明显的协同作用，还将进一步研究两药联用对乳腺癌微环境及肺转移的影响，前景可观。基于上述成就，我们势必要用干细胞微球体培养方法，将三氧化二砷联合粉防己碱作用于三阴乳腺癌干细胞，观察其对微球体细胞的形态改变，对细胞增殖、生长周期、凋亡及砷的代谢、耐药蛋白、CD44、CD24等干细胞标志物表达差异的影响；研究药物对干细胞信号通路及相关基因的调控；进一步探讨其对干细胞端粒酶的活性影响。以期在中医药治疗三阴乳腺癌方面有新的突破。

三阴乳腺癌作为临床治疗难点，乳腺癌干细胞可能是其起源、复发与转移的真正原因。根据中医药理论“防己杀雄黄毒”药物配伍理论，结合前期研究结果，我们通过微球体富集法培养三阴性乳腺癌MDA-MB-231干细胞，采用流式技术检测CD44、CD24，q-PCR技术检测Sox2、Oct4等干细胞标志物，并通过Transwell法检测干细胞侵袭力，从而成果获得乳腺癌MDA-MB-231干细胞。通过MTT法评价不同浓度和时间点三氧化二砷和粉防己碱对MDA-MB-231干细胞作用，利用中效原理分析两药联合作用，进而得到两药协同浓度组合。.研究的主要内容包括：①流式细胞技术检测药物对细胞凋亡和周期的影响作用；②流式细胞技术和免疫荧光技术检测药物对干细胞标志物CD44+CD24-比例的影响；③Elisa检测与砷吸收与排泄相关蛋白AQP9、ABCC、MRP1、MDP1含量和耐药因子p-gp、TopoⅡ和GST-π含量；以及干细胞端粒酶活性；④电感耦合等离子体质谱法检测用药后干细胞内砷含量；⑤Western blot检测Hedgehog、Wnt-1/β-catenin、PTEN、Notch1蛋白的含量。.研究结果发现：①三氧化二砷和粉防己碱单用及在协同浓度下合用，可明显诱导乳腺癌MDA-MB-231干细胞凋亡和阻滞其周期，且合用效果优于单药；②三氧化二砷和粉防己碱单用及在协同浓度下合用可明显降低干细胞标志物CD44+CD24-比例；③三氧化二砷和粉防己碱单用及在协同浓度下合用，可降低与排泄相关蛋白AQP9、ABCC、MRP1、MDP1以及耐药蛋白p-gp、TopoⅡ和GST-π含量，同时药物单用或合用时可明显降低端粒酶活性，且合用时效果明显；④粉防己碱可明显降低合药使用时干细胞内砷的含量；⑤三氧化二砷和粉防己碱单用或合用抑制增殖、诱导凋亡、阻滞周期的作用可能是通过调控Hedgehog实现的。.结论及意义：三氧化二砷与粉防己碱配伍组合对乳腺癌干细胞作用明显，同时两药协同浓度下联合使用存在“减毒增效”的效果，也存在实现逆转肿瘤治疗逆转耐药性的可能，在一定程度上证实了中医药配伍理论“防己杀雄黄毒”的科学性，值得进一步深入研究。