防己黄芪汤系统调控EMT抗乳腺癌侵袭转移的研究

The main causes of Breast cancer patients with poor prognosis are cancer metastasis and relapse，which has been demonstrated to related to Epithelial-mesenchymal transition（EMT). We have previously reported the effects of Fangjihuangqi tang on inhibiting the invasion and metastasis of breast cancer cells in vitro, then we hypothesized that the primary mechanism is based on EMT. However, the underlying molecular mechanisms of Fangjihuangqi tang inhibits EMT in breast cancer remains unclear. In this study, first, we are going to establish a zebrafish model of transplanted tumors and an EMT model of TGF-β-induced breast cancer cells, then we will use high-content screening for genes, Immunofluorescence, immunohistochemistry, fluorescence quantitative PCR, western blot and other techniques. From the aspects of celluar and molecular, It aims to find out the key factors, activity markers and related transcription factors that play a key role in the machanisms of Fangjihuangqi tang inhibits EMT which are may be promising targets for treatment.

乳腺癌的侵袭转移是导致患者预后不良的原因，调控上皮间质化（EMT）可有效地抑制乳腺癌的侵袭和转移。前期研究发现防己黄芪汤可以降低乳腺癌细胞的迁移能力，我们提出“防己黄芪汤可系统调控乳腺癌侵袭和转移的核心因素EMT”的科学假说。本项目拟建立乳腺癌移植瘤的斑马鱼模型和TGF-β诱导乳腺癌细胞的EMT模型，采用高内涵基因功能筛选，免疫荧光、免疫组化、荧光定量PCR、western blot等技术，从整体、细胞、分子生物学等不同层面对防己黄芪汤调控乳腺癌EMT相关的关键因子、标志物及相关转录因子进行研究，以期阐明防己黄芪汤通过抑制EMT而产生的抗乳腺癌侵袭转移的靶点和机制，为中医药抗乳腺癌侵袭转移提供科学依据。

目前针对乳腺癌的转移复发没有较确切肯定的防治方法，调控EMT从而对抗乳腺癌转移复发成为近年来研究的热点。团队前期研究中发现防己黄芪汤具有抑制乳腺癌细胞作用，并可降低其侵袭迁移能力。因此我们通过本研究明确防己黄芪汤对EMT相关因子通路关系的影响作用机制，并对相关因子与通路进行探索和验证。.研究内容：1.利用TGFβ1诱导MDA-MB-231细胞EMT模型；细胞模型成功后，使用防己黄芪汤含药血清（FHS）干预细胞；利用MTT法检测FHS对癌细胞增殖的影响，利用Transwell法检测FHS对癌细胞侵袭能力的影响，利用Western Blot和rt-qPCR法检测对FHS对癌细胞EMT生物标志物的影响，并通过高通量二代测序筛选FHS抗乳腺癌EMT的基因靶点及信号通路，并进行生物学行为验证。2.建立斑马鱼三阴性乳腺癌移植瘤模型，并评估防己黄芪汤对癌细胞增殖和侵袭的作用；体轴发育和尾鳍再生实验，检测防己黄芪汤对Wnt通路的作用。.研究结果：1.TGFβ1诱导后的MDA-MB-231细胞可呈现EMT特性。2. FHS干预后，能抑制细胞增殖，降低细胞侵袭能力，可下调EMT因子表达，呈现逆转EMT的作用。3.TGFβ1+FHS组 vs TGFβ1组差异基因的KEGG pathway富集生物学过程（BP）层面涉及的通路主要包括：TNF、NF-κB、IL-17等，差异基因表达趋势为先升后降的代表性三角形线条共2145个。挑选效果最为明显的10个基因进行后续筛选发现，相比于shCtrl，shDHRS2可明显抑制MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力，升高E-cadherin蛋白的表达，降低N-cadherin、Vimentin、TWIST蛋白的表达。4.斑马鱼三阴性乳腺癌移植瘤模型结果显示：防己黄芪汤可通过升高E-cadherin蛋白的表达，降低EMT生物标志物蛋白和基因的表达，抑制肿瘤的生长，改善肿瘤细胞的异型性，抑制肿瘤新生血管生成的芽数，并降低肿瘤新生淋巴管的长度。.结论： 防己黄芪汤可通过增加E-cadherin的表达，降低EMT生物标志物的表达，逆转EMT发生，进而发挥抗乳腺癌转移的作用，其作用机制与降低DHRS2的表达关联性更大。