发展外源抗原特异性CAR-T策略清除乙型肝炎病毒持续感染

Covalently closed circular (ccc) DNA of hepatitis B virus (HBV) is regarded as a primary molecular mechanism for HBV persistence. Current antiviral treatments fail to eliminate the preexisting cccDNA pool that is responsible for viral rebound after therapy cessation. Theoretically, killing of the residuary HBV-infected cells is capable of eliminating cccDNA in vivo. In this study, we propose a new approach of foreign-antigen-based chimeric antigen receptor T-cell (CAR-T) immunotherapy trying to cure chronic HBV infection. We plan to design a foreign-antigenic recombinant HBV (rHBV) to target wild-type (wt) HBV-producing hepatocytes, by which to direct the attack by antigen-specific CAR-T cells after adoptive transfer in vivo. Disruption of the core gene renders rHBV replication deficient except in cells already infected with wt HBV. Particularly, we will focus on how to functionally modify the viral genome, in order to generate an rHBV capable of dominant viral replication over wt HBV. Thus, targeting of cccDNA-bearing cells can be achieved with high efficiency during rHBV co-infection. To ensure the validity and safety, a proof-of-concept study will be further performed in HBV-susceptible cell line and human liver chimeric mice, as well as in our newly reported mouse model with recombinant cccDNA persistence.

乙型肝炎病毒（HBV）共价闭合环状DNA（cccDNA）是病毒慢性感染的分子基础，目前的临床抗病毒治疗并不能清除cccDNA，是停药后复发的主要原因。理论上，清除残留的HBV感染细胞能够彻底清除cccDNA。本研究拟发展基于外源抗原特异性的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）免疫治疗，通过重组HBV（rHBV）表达的外源抗原标记野生病毒共感染细胞，由过继性输入方式引导外源抗原特异性CAR-T细胞的免疫杀伤，最终清除HBV感染。rHBV是一种核心抗原删除的缺陷病毒，在野生病毒共感染的肝细胞中，通过反式互补实现复制；另一方面，我们将通过删除和突变筛选，使rHBV获得反式互补条件下的优势复制，rHBV因此可以高效标记野生病毒残留细胞。进一步，我们拟基于体外感染细胞模型，人肝细胞嵌合小鼠模型，以及我们新近建立的HBV cccDNA持续感染小鼠模型，对外源抗原CAR-T策略有效性和安全性进行概念性验证。

乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染仍然是严重的公共卫生问题。特异性T细胞免疫应答失能或耗竭，是HBV持续性感染的重要特征。既往研究显示，过继性输入的病毒特异性CAR-T细胞能够在小鼠肝脏中募集，清除HBV转基因小鼠肝脏中的病毒复制。尽管如此，HBV特异性CAR-T策略的合理性仍具有较多争议：HBV持续感染累及大量肝脏细胞，血清中分泌抗原可能重复刺激抗原特异性CAR-T细胞耗竭；此外，病毒抗原是否跨膜锚定于细胞表面，缺乏理论和实验证据支持。本项研究中，我们发展了一种基于外源抗原特异的CAR-T细胞清除HBV持续感染的免疫治疗策略：通过设计构建了一种核心抗原（HBc）缺陷的重组HBV病毒（rHBV），只有在野生病毒共感染的肝细胞中，由野生病毒反式提供HBc，rHBV才能够实现复制和表达重组外源抗原。rHBV具有相对的复制优势，因此可以标记野生HBV感染细胞，使其成为外源抗原特异性CAR-T细胞的靶标。HBV基因组高度压缩，难以容纳较大片段的外源基因，因此，rHBV作为基因治疗载体是本项课题的主要研究内容。本研究构建的荧光蛋白重组HBV复制子系统能够为HBV高通量药物筛选和HBV从头感染研究提供实验工具，具有重要的病毒学意义和应用前景。在此基础上，我们进一步设计rHBV载体，使其能够容纳重组的多发性骨髓瘤标志抗原（BCMA）基因，包括信号序列，CAR-T识别的细胞外构象表位区段，穿膜锚定序列等，能够在HBV核心抗原互补条件下挽救病毒复制。另一方面，我们构建和制备BCMA特异性CAR-T细胞，在体外培养细胞水平证实其有效性；进一步，我们发展了HBV重组cccDNA持续表达的实验小鼠模型，证实BCMA特异性CAR-T细胞能够有效清除小鼠肝脏中野生病毒与BCMA重组病毒的共感染。本项研究因此代表了一种能够有效清除HBV持续感染的新型免疫治疗策略，为实现HBV治愈提供新思路。