精子液态储存的分子机制-基于中华鳖输卵管模式

Sperm storage in liquid is a special reproductive strategy evolved by some animals, which can extend the period of fertiliation effectively, and increase reproductive ratio successfully. Our previous work has revealed that Chinese soft-shelled turtle can be a typical model in long-term sperm storage. Morphological relationship between sperm and epithelium is very close, and the immune reaction of androgen receptor in storage region is positive. This project will show the diversify pattern of androgen level during sperm storage by cellular and molecular methods. Structure and mobility of stored sperm are examined before and after flutamide (anti-androgen) treatment. Expression of androgen receptor,Bcl-2, Caspase-3 and MAP kinase in isthmus and uterine part of oviduct is analized quantitatively. Proteins above and their genes on the epithelium of cultured oviduc are further investigated after treatment by testosterone or testosteroneand flutamide in vitro. Regulation of androgen and its signal pathway in liquid sperm storage of soft-shelled turtle will be elucidated according the reseach experiments in vivo and in vitro. Results of this project could provide an theoretical enlightenment for the development of new technology in liquid sperm conservation in vitro.

精子液态储存是某些动物进化的一种特殊生殖策略，能有效延长受精时间，提高繁殖成功率。课题组前期的实验发现，中华鳖液态精子储存现象典型，储存部位的上皮与精子之间联系紧密，且上皮细胞的雄激素受体呈阳性免疫反应。本项目以此为切入点，将在细胞和分子水平上，揭示精子液态储存期雄激素水平的变化规律；显示氟他胺（雄激素拮抗剂）处理前后，储存精子的结构和活力的变化特征，定量分析雄激素受体、Bcl-2、Caspase-3和MAP激酶在输卵管峡部和子宫部（精子储存微环境）的表达规律；进一步通过输卵管上皮组织的体外培养，检测睾酮或睾酮与氟他胺联合作用后，上述相关蛋白及其基因的表达动态，进而分析雄激素依赖性信号途径在峡部和子宫部的调节作用。通过体内和体外实验，从不同角度阐明雄激素及其调控系统在中华鳖输卵管（天然模型）精子液态储存中的作用机理。研究结果可为体外精子液态保存新技术的建立提供独特思路和理论支撑。

精子储存是许多动物的一种特殊生殖策略，能有效延长受精时间，提高繁殖成功率。中华鳖精子分别储存于雄性的附睾和雌性输卵管的峡部至阴道部前段，储存时间分别为6个月和12个月。精子的胞质小叶及其脂滴、洋葱样线粒体等超微特征，能够维持其长寿命；附睾和输卵管形态特征及其屏障结构，为精子储存提供稳定内环境；雌鳖雄激素水平与输卵管雄激素受体表达随季节变化，其动态规律与精子储存密切相关，这一结果也得到氟他胺抑制试验的反向验证，表明雄激素及其受体调控输卵管精子储存；输卵管上皮细胞的批量顶浆分泌、两相分泌以及腺细胞的层状颗粒分泌等，为储存精子提供有效的营养支持；抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Caspase-3在中华鳖输卵管精子储存部位（阴道、子宫、峡）的分布动态与精子储存阶段相对应，显示出精子储存期细胞凋亡水平低。在完成计划任务的同时，课题组还开展了进一步的深入研究。附睾的外泌体（Exosomes）及其与储存精子互作，有利于精子的长期储存；附睾与输卵管黏膜均表达TLR2/4，精子本身也表达TLR2/4，这些免疫因子具有抵御感染、保护精子免受损失的作用；输卵管上皮与固有膜等鲜有免疫细胞分布，储存部位不具备免疫排斥的细胞学基础；通过RNA高通量测序技术，鉴定出4572个差异基因，这些基因与免疫、细胞凋亡和自噬等有关，它们均参与精子储存过程；进一步揭示了细胞自噬参与精子储存的调节，并以中华鳖精子发生为模型，发现并绘制了自噬体膜的形成机制；TUNEL实验显示，精子发生中期和晚期Bcl-2高表达，Caspase-3低表达，线粒体膜电位显著升高，且降低CytC由线粒体释放入细胞质，表明凋亡水平显著下调；利用形态学方法探究了中华鳖睾丸支持细胞自噬与精子发生的关系，发现支持细胞脂滴自噬调控鳖精子发生过程。上述结果，从精子本身、储存微环境以及精子与微环境互作三个不同的角度，揭示了精子储存的细胞分子机理，也为体外精子液态保存新技术的建立奠定理论基础。