鸭坦布苏病毒突破血-脾屏障引发脾免疫微环境变化的机理研究

Duck Tembusu virus （DTMUV） is a new infectious virous which seriously affects duck industry. Our previous works showed that the spleen was the most diseased organ which was the highest viral load. According to the previours research work, we are going to detect the molecular cell mechanism of DTMUV invasion into duck spleen through the newly reported blood-spleen barrier (BSB). High endothelial blood vessel within the BSB is the location where lymphocyte homing takes place in the poultry, and differentially expressed genes associated to lymphocyte homing are screened and identified by RNA-seq sequencing. Interactions between lymphocytes and High endothelial cells are investigated by using fluorescent double labeling technique and laser screen confocal microscopy. The influences on lymphocyte homing dynamic by DTMUV incursion are further analysed. The inherent law of variation in regional constructions and immune microenvironments of duck spleen is examined under DTMUV infection conditions. The Pathological mechanism of DTMUV infection is going to be elucidated on tissue, cell and molecular levels. All the results will provide the theoretical principle for DTMUV disease prevention and vaccine development.

鸭坦布苏病毒（DTMUV）是一种严重影响我国养鸭业的新发传染病病原。课题组前期实验结果显示，脾脏是DTMUV感染时病变最明显、病毒含量最高的器官。以此为切入点，申请者拟综合运用形态学和分子生物学方法，探究DTMUV突破鸭血-脾屏障（BSB）的动态机制；禽类BSB的高内皮血管是淋巴细胞归巢的发生部位，通过RNA-seq测序技术筛选鉴定不同感染期脾脏淋巴细胞归巢相关差异表达基因，同时利用荧光双标和激光共聚焦技术厘清淋巴细胞与高内皮归巢分子的互作关系，进而分析DTMUV感染对脾脏淋巴细胞归巢过程的影响。在此基础上，通过显示脾脏各种免疫细胞分布和细胞因子表达变化，进一步揭示DTMUV感染条件下鸭脾结构区域及其免疫微环境改变的内在规律。研究结果将从新发现的禽类BSB的特殊角度，在组织、细胞和分子水平上阐明DTMUV的感染机制，为制定有效的防控措施和研制特异的DTMUV疫苗提供科学的理论支撑。

禽类血-脾屏障（BSB）是课题组原创发现的一种免疫屏障，能阻滞外来抗原入侵脾组织。结合鸭坦布苏病毒（DTMUV）病的在国内流行现状，本项目对DTMUV突破BSB并引发脾免疫微环境变化的细胞分子机制开展了深入研究。在观测鸭BSB的微细构造与细胞组成的基础上，利用DTMUV感染实验鸭，发现攻毒后2小时病毒入侵淋巴细胞和巨噬细胞，并在2小时至3天复制明显增多，而在6-18天病毒逐渐清除；在体研究了DTMUV感染脾脏的细胞分子机制，认为DTMUV通过RIG-I侵染脾脏，并在感染早期，通过抑制MHC-II表达来促进其免疫逃逸。DTMUV刺激IL-6表达可诱导脾脏损伤。DTMUV增强RLRs、抗病毒I型IFNs、淋巴细胞归巢基因和蛋白的表达，增加淋巴细胞数量。进一步发现鸭BSB血管具有高内皮结构，是发生淋巴细胞归巢的部位。应用RNA-seq技术筛选不同感染期鸭脾淋巴细胞归巢相关差异表达基因，厘清淋巴细胞与高内皮细胞归巢分子的互作关系；尤其发现DTMUV可利用外泌体介导途径入侵宿主，原创性报道外泌体及其多泡体在感染鸭脾体内的分布规律，绘制了外泌体动态分布模式图。项目组还探究了禽BSB的胚后发育机制，发现BSB形态与结构随发育进行而不断完善，抵御外源性颗粒抗原能力也逐渐增强，T、B淋巴细胞和抗原呈递细胞的数量增加，BSB高内皮出现，间断的基底膜增厚。TLR2/4, IL-2, IFN-γ和 TNF-α的mRNA表达水平在出壳后2周较高，但随后降低，在21至60天维持稳定。在完成计划任务之后，我们进一步开展了细胞自噬、凋亡、外泌体以及新间质细胞的发现等方面的研究，并取得实质性进展。上述研究成果，不仅从BSB新角度阐释了DTMUV病的发病机制，为DTMUV病的防治及其疫苗研发提供独特思路，而且丰富和发展了禽类比较免疫学内容。