蓝藻利用CO2合成聚异戊二烯代谢途径构建方法的研究

Natural rubber (polyisoprene) is used for industrial manufacturing because of its good properties. However, the low yield of natural rubber can not meet the requirement of economic development, on the other hand, the production process of synthetic rubber which uses fossil energy as the substrate produces harmful substances which greatly threaten to our environment. While the greenhouse effect caused by the carbon dioxide emission is increasing seriously which also influence our ecological environment. In addition, presently isoprene is used as the precursor for making polyisoprene. Isoprene is gas at normal temperature, difficult to recycle, and it is toxic to cyanobacteria. Based on this, in this project, we will build metabolic pathways to synthesize polyisoprene by using cyanobacteria absorbing carbon dioxide directly. We plan to realize cyanobacteria absorb carbon dioxide and simultaneously produce high value-added natural rubber through introducing cis-prenyltransferase (CPT), and reveal the reaction mechanism. At the same time, we will modify the MEP metabolic pathways of cyanobacteria, improve the yield of intermediate products IPP and DMAPP from recombinant cyanobacteria for creating more polyisoprene, and we will also study the mechanism of the pathways. This project will give theoretical and practical values for biosynthesis natural rubber using cyanobacteria directly.

天然橡胶(聚异戊二烯)以其优良的性能被广泛应用于工业制造中，目前其产量严重短缺，不能满足经济发展的需求; 以传统化石能源为基质的合成橡胶的生产过程对环境造成极大的威胁；另外近年来由于二氧化碳的大量排放而造成的温室效应日益严重，给人们的生态环境带来了威胁；而且目前生产聚异戊二烯的前体物质异戊二烯常温下为气体难以回收且对蓝藻有毒性，为此本项目本着低碳环保可持续发展的宗旨，通过构建蓝藻合成聚异戊二烯代谢途径使其能够直接利用CO2合成聚异戊二烯。引入代谢路径关键酶顺式-异戊烯基转移酶，实现蓝藻固定二氧化碳的同时直接产生高附加值产品聚异戊二烯，揭示聚异戊二烯与蓝藻适配性的作用机理。同时拟对蓝藻的MEP代谢途径进行改造，提高重组蓝藻的中间体IPP和DMAPP 的产量，使之有利于聚异戊二烯的生成，从而极大提高目标产品产量并诠释其代谢机理。该项目研究对蓝藻直接生物合成天然橡胶具有重要的理论意义和应用价值。

天然橡胶是来自于生命体的天然高分子材料，主要是以聚异戊二烯为主要成分。本项目目的主要是利用基因工程技术和酶工程技术对蓝藻的代谢途径进行改造和构建，使其在固定二氧化碳的同时生产高附加值的产品聚异戊二烯（天然橡胶）。. 项目组通过数据库检索、基因比对设计了几种不同来源的聚异戊二烯合成酶序列，前期以研究成熟的大肠杆菌为底盘细菌，引入聚异戊二烯合成酶，对待选酶进行评价，结果拟南芥来源的聚异戊二烯合成酶可以较好的表达。在此工作过程中，成功开发了一种用LC-MS检测底物异戊酰焦磷酸（IPP）、法尼基焦磷酸（FPP）的方法代替文献中以带14C放射性标记的IPP作为检测基质，探索了多种检测产物焦磷酸（PPi）的方法技术。同时对大肠杆菌进行了代谢途径改造，增强合成FPP途径的C流，获得了具有聚异戊二烯合成代谢途径的大肠杆菌。. 本项目重点以集胞藻6803（Synechocystis sp. PCC 6803）为宿主，利用其MEP代谢途径前体物IPP与FPP，导入编码关键酶顺式-异戊烯基转移酶（cis-prenyl transferase，CPT）的外源基因，即橡胶草来源的TkCPT、拟南芥来源的ACPT基因，构建了具有合成聚异戊二烯代谢途径的基因工程菌。同时对集胞藻6803的MEP途径进行了优化，以期增加前体供应量。通过分子生物学检测证实，橡胶草来源的TkCPT、拟南芥来源的ACPT基因以及改造MEP途径各基因可以在集胞藻6803中正确表达，表达量相较于改造前菌株有明显的正向趋势。在持续光照下，野生型Synechocystis sp. PCC6803与改造后的集胞藻6803菌在生长初期和对数生长期都未见显著的差异。. 另外，本项目在代谢路径优化的大肠杆菌中，引入长叶烯合酶，成功在大肠杆菌中实现了长叶烯（萜类物质）的生物合成，表明本课题已成功建立萜类物质生物合成平台。. 综上，本项目成功的在大肠杆菌和集胞藻6803中表达了顺式-异戊烯基转移酶，并利用代谢工程技术对该两种底盘菌株进行代谢路径的优化，获得了具有合成聚异戊二烯代谢途径的基因工程菌。建立了大肠杆菌和集胞藻6803生产萜类物质的合成生物学平台，为其它异戊二烯类（萜类）物质的生物合成研究奠定基础。..