RyR钙释放通道-调节蛋白复合体的结构与功能研究

Ryanodine receptor(RyR) is an ion channel located in membrane of sarco(endo)plasmic reticulum(SR/ER), which functions as a calcium release channel in response to stimuli to release calcium from SR/ER to initiate calcium-activated biological activities. In situ, RyR interacts with an array of proteins that regulate the calcium release activity of RyR。These prteins include calsequestrin, triadin and junctin.It has been proposed that these proteins form a super molecular complex with RyR to modify its structure and function. Although molecular biology,biochemistry and electrophysiology experiments have sugggested these proteins may form a super molecular complex with RyR and regulate its structure and function, the structural basis and working mechanism are still unknown.In this project, we will use structural biology (cryo-EM) in conmbination with biochemistry and electrophysiology methodologies to investigate the interactions of these regulatory proteins with RyR and their effects on the calcium release channel, to reveal the structural basis and working mechanism of their action.

Ryanodine 受体（RyR）是定位于细胞肌浆网/内质网膜上的离子通道，其功能是在细胞受激时将肌浆网/内质网贮存的Ca2+离子释放至细胞浆内，引发Ca2+激活的生物学过程。RyR在细胞肌浆网原位与多个蛋白相互作用，调节RyR通道的钙释放功能。这些蛋白包括calsequestrin, triadin和junctin。实验表明，这些蛋白与RyR形成一个超分子复合体，调节RyR的结构与功能。虽然分子生物学、生物化学、电生理学实验表明这些调节蛋白与RyR形成超分子复合体并调节RyR/Ca2+释放通道功能，但其结构基础及工作机制尚不清楚。本项目拟以RyR1-调节蛋白复合体为研究对象，应用结构生物学（cryo-EM）结合生物化学、电生理学方法研究调节蛋白与RyR1的相互作用及其对RyR1/Ca2+释放通道功能的影响,阐明调节蛋白与RyR相互作用并调节RyR/Ca2+释放通道的结构基础和工作机制

Ryanodine受体 (RyR) 是最主要的一种细胞内钙释放通道，能迅速地将Ca2+从钙库中释放出来，参与多种重要的生理过程，如基因表达调控、神经传导和肌肉收缩。RyR功能失调将导致重大疾病，如中心核疾病、恶性高热和心脏病，严重者可引起心脏骤停，导致猝死。RyR的通道活性受到多种内源性蛋白质的调控。本项目拟应用结构生物学方法研究RyR的结构、RyR调节蛋白如DHPR的结构以及RyR-调节蛋白复合体的结构，揭示RyR结构与功能的关系，以及调节蛋白调节RyR功能的结构基础。.本项目开展了RyR、DHPR的结构生物学研究以及调节蛋白CSQ-RyR复合体的结构生物学研究，取得了重要进展。.（1）RyR结构：我们应用最新的冷冻电镜三维重构技术，获得了RyR1关闭态的3.8-Å分辨率三维结构和钙激活的RyR1开放态4.2-A分辨率三维结构。通过结构分析，揭示了RyR通道属于6次跨膜螺旋阳离子通道家族，RyR通道广谱阳离子选择性的化学基础，RyR通道开关和调节因子长程变构调节通道的结构机制，以及突变引起通道异常并导致重大肌肉相关疾病如心脏骤停导致猝死的结构基础。.（2）DHPR结构：我们通过冷冻电镜三维重构，获得了DHPR的三维结构。通过利用同源钠通道晶体结构，建立了DHPR/L型钙通道的结构模型，揭示了通道的构造；结合特异性抗体标记，确定了DHPR在细胞膜上的拓扑取向。该工作为进一步研究DHPR-RyR耦联奠定了基础。.（3）RyR-CSQ复合体的结构：CSQ是一种调节蛋白，调节RyR的通道功能。揭示RyR-CSQ复合体的三维结构对于阐明CSQ调节RyR的工作机制是必不可少的。目前虽然已有多个研究组对RyR的三维结构进行了研究，但是尚无RyR-CSQ复合体结构的研究。我们通过改进纯化方法，获得了化学上纯度高，物理上形态均一的RyR和CSQ样品。通过冷冻电镜三维重构，获得了RyR-CSQ复合体的三维结构。该工作为进一步研究CSQ调节RyR的功能奠定了基础。