Junctin蛋白对钙释放通道RyR1结构和功能调节的研究

Interaction between Junctin and Ryanodine receptor (RyR) is one of the most important regulation factors of excitation-contraction coupling in muscle cells. Variety of factors can affect the effects of Junctin on RyR1. At present, the structural basis of Junctin regulation of RyR1 is not known. How does Junctin bind to RyR1? What are the structural changes of RyR1 upon Junctin binding? How does the channel activity change when the complex structure changes? In this project, we design different conditions based on calcium concentration and auxiliary protein, and apply cryo-electron microscopy, combining with biochemical and electrophysiological methods to study the relationship between structural changes and channel activity of Junctin regulation on RyR1 under different conditions. The results will illuminate the regulation mechanism of Junctin on RyR1 and provide structural basis for the intervention and treatment of critical RyR1 related diseases.

Junctin蛋白和钙释放通道（RyR）的相互作用是肌细胞兴奋-收缩偶联最重要的调节环节之一，Junctin对RyR1的作用受到多种因素的影响。目前，Junctin对RyR1调节作用的结构基础和工作机制尚不清楚，Junctin与RyR1如何结合？Junctin作用后RyR1的结构发生了什么样的改变? 这些结构的改变对RyR1通道产生什么样的影响？为了回答这一系列问题，本项目将以钙离子浓度和RyR1附属蛋白作为主要影响因素，设定Junctin和RyR1发生作用的不同反应条件，应用冷冻电镜技术，结合生物化学和电生理学实验，系统研究在不同条件下Junctin作用后，Junctin-RyR1复合物的结构变化和通道活性的关系，阐明Junctin对RyR1的调节机制，为干预和治疗RyR相关的重大疾病奠定结构基础。

蛋白质1型Ryanodine受体是人体骨骼肌中的重要的钙离子释放通道，在骨骼肌的兴奋-收缩耦联中起到重要的作用。RyR1受体的细胞体内功能实验表明，仅需要钙离子的作用即可使得该通道处于“开放”状态。但在已发表的RyR1的受体结构生物学文章中，单纯的钙离子并不能使得RyR1蛋白达到“开放”状态， 而是需要加入额外的外源性调节因子，如咖啡因，ryanodine， PCB-95及二酰胺等才能让RyR1蛋白处于“开放”状态。.我们的研究认为，RyR1在细胞内正确行使功能需要内源性胞内蛋白Junctin的存在；我们使用了一种温和的蛋白纯化方法纯化出RyR1-Junctin蛋白的复合物。在我们纯化出的RyR1-Junctin蛋白复合物的体外实验中，仅依靠钙离子本身，无需额外的调节因子，便可以使得RyR1处于“开放”状态。使得该蛋白结构生物学观察和功能学上的结果第一次达成一致。我们利用冷冻电镜等结构生物学手段，进一步确认了Junctin蛋白和RyR1作用的具体机制，即Junctin蛋白将其跨膜区螺旋插在RyR1蛋白的S1螺旋，S4螺旋及S4-5螺旋连接处，在跨膜区处形成了一个向外的力来影响RyR1 S6螺旋，进而协助RyR1蛋白的“开放”。.我们的研究证实了在真实的生理条件下，RyR1-Junctin形成的内源性的复合物是RyR1正常行使功能的重要因素。该研究为RyR1功能异常引起的先天性肌肉疾病患者的治疗研究提供基础研究支撑，同时也指出了结构生物学在研究中使用离体表达纯化蛋白的潜在风险，即脱离了蛋白天然的环境及周围的协同作用蛋白后，需警惕仅使用离体蛋白得出生物学结论的可靠性。