Ryanodine受体钙离子释放通道RyR1的晶体结构研究

Ryanodine受体（RyR）是由四个亚基组成的钙离子释放通道，分子量最大的膜蛋白，呈四重对称结构，在肌肉兴奋-收缩耦联等过程中起重要作用，突变将引起恶性高烧等多种离子通道病。冷冻电镜研究得到了大量结构信息，包括胞浆复合体1-10结构域，差异区的定位等，并得到RyR1 9.6 ? 分辨率的空间结构；去年国外研究组重组表达了RyR1, RyR2氨基端约200个氨基酸, 解析了N端的晶体结构，确认了RyR1上恶性高烧等通道病的突变"热点"环，揭示出RyR2点突变引起蛋白质表面的显著变化。但是，RyR跨膜区和孔道仍有许多待解之谜，N端晶体结构反映的未必是其在整个RyR分子上的真实折叠情况，整个RyR分子的晶体结构亟待解析。申请者成功培养了RyR1三维晶体，本项目将优化结晶条件，用9.6 ?分辨率的冷冻电镜结构作初始模型求解相位，测定晶体结构，阐明其结构与功能的关系和钙离子通道病的分子机制。

Ryanodine受体（RyR）是由四个亚基组成的钙离子释放通道，分子量最大的膜蛋白，2300 kDa,分为骨骼肌型RyR1、心肌型RyR2和脑型RyR3。RyR1在肌肉兴奋-收缩耦联等过程中起重要作用，突变将引起恶性高烧等多种离子通道病。冷冻电镜研究得到RyR1 9.6 A 分辨率的空间结构；国外研究组重组表达并解析了RyR1和RyR2的局部结构域（大约200个氨基酸）的晶体结构，但反映的未必是其在长达5000多个氨基酸的整个RyR分子上的真实折叠情况。整体RyR分子的晶体结构亟待解析。. 膜蛋白的纯化本身就很难，膜蛋白的结晶更困难，膜蛋白晶体对X-射线衍射也很弱，晶体冷冻保护剂的选择特别重要。本项目主要进展和所取得的成果如下：（1）通过反复优化RyR1纯化方案，纯化出足量均一的RyR1，负染电镜显示RyR1形态完整，适于培养晶体；（2）经过多次晶体培养实验，培养出RyR1与离子通道抑制剂钌红的共结晶晶体，晶体呈粉红色，块状，与RyR1分子本身形状（方形）相契合；（3）多次到上海光源BL17U 线站进行X射线衍射实验，通过挑选合适的晶体冷冻保护剂，RyR1晶体得到了X-射线衍射，分辨率为15 Å；（4）应用蛋白质组学进行了分析肌浆网膜SR重膜和轻膜，发现SR与T管、线粒体均有连接；蛋白质组学分析纯化的线粒体相关膜（MAM），发现线粒体与SR、T管也有连接。表明骨骼肌的兴奋-收缩耦联与线粒体的兴奋-代谢耦联存在物理和功能上的关联。为RyR1的结构和功能研究打下了良好的基础。. 总之，RYR是已知的分子量最大的膜蛋白，本项目在纯化RyR1、RyR1结晶和RyR1晶体X-射线衍射方面，都获得一定突破。目前，RyR1晶体衍射到15 Å， 尚不能解析出晶体结构，进一步的优化工作正在进行中。