兴奋-收缩耦联过程蛋白质复合体的结构与功能调控

Excitation-contraction coupling is the process of excitation leading to contraction of muscle cells. Ryanodine receptor (RyR) plays a critical central role during excitation-contraction (E-C) coupling. The RyR is activated upon receiving an excitation signal and release Ca2+ from sarcoplasmic reticulum into cytosol, leading to contraction of muscle cells. The dysfunction of RyR would result in vital diseases, such as neurodegenerative diseases, metabolic syndrome and heart diseases. RyR is the key target for drug development to treat these diseases. In situ, skeletal RyR1 interacts with surface membrane calcium channel DHPR, forming RyR1-DHPR complex，which play a key role in E-C coupling; a variety of regulatory proteins, forming RyR-regulatory protein complexes and regulating its channel function and E-C coupling. The structural basis and action mechanisms of RyR1-DHPR coupling and the regulation of RyR1 function by regulatory proteins, however, are not known. Supported by the NSFC from the project previously granted, we successfully solved the closed-state and open-state structures of RyR1 to high-resolution. In this project, we propose to solve the high-resolution structures of RyR1-DHPR and RyR1-regulatory protein complexes by cryo-electron microscopy, combining with biochemical and electrophysiological studies, to elucidate the structural basis and action mechanisms of RyR1-DHPR coupling and the regulation of RyR1 function by regulatory proteins.

肌细胞由兴奋导致收缩的过程称为兴奋-收缩耦联。Ryanodine 受体（RyR）在兴奋-收缩耦联过程中起至关重要的核心作用。RyR功能异常，常常导致严重疾病，如神经系统疾病、代谢综合征和心脏病。RyR因此成为治疗这些疾病的关键靶标。骨骼肌RyR1与细胞膜上钙通道DHPR形成RyR1-DHPR复合体，在兴奋-收缩耦联中起核心作用；RyR与多个调节蛋白形成RyR-调节蛋白复合体，调节RyR通道的功能和兴奋-收缩耦联。DHPR-RyR1耦联及调节蛋白调节RyR1功能的结构基础及工作机制尚不清楚。我们在基金委面上项目支持下，应用冷冻电镜成功的解析了RyR1关闭态和开放态的高分辨三维结构。本项目将应用冷冻电镜研究RyR1-DHPR和RyR1-调节蛋白复合体的高分辨三维结构, 结合生物化学和电生理学，阐明DHPR-RyR1耦联和调节蛋白与RyR相互作用并调节RyR/钙释放通道的结构基础和工作机制。

本课题旨在应用生物物理学方法研究RyR-调节蛋白的相互作用，并用冷冻电镜研究RyR-调节蛋白复合物的结构，阐明RyR-调节蛋白的结构基础和工作机制。我们的研究发现（1）RyR1可与CSQ发生相互作用（Kd=1.6×10-8 M）；（2）RyR1可与junctin发生相互作用（Kd=1.0×10-9 M）；（3）冷冻电镜研究表明，与文献中假设的CSQ作用于RyR1的跨膜螺旋5-6环不同，CSQ作用于RyR1的跨膜螺旋1-2环；（4）冷冻电镜研究表明，junctin以单次跨膜螺旋方式插入到RyR1的跨膜区，与RyR1的跨膜螺旋1和4-5 linker发生疏水相互作用，从而控制RyR的门控。.本课题的重要成果：RyR的功能研究表明，钙离子是RyR重要的调节因子。钙离子单独即可激活RyR通道，钙离子与ATP共同作用，可完全激活RyR通道。但到目前为止，所有的结构研究都表明，钙离子单独不能完全激活RyR通道，甚至钙离子与ATP共同作用亦不能完全激活RyR通道。结构与功能研究的矛盾是RyR研究领域的一个悬而未决的重要问题。由于RyR的结构工作使用了纯化的RyR蛋白，而功能工作使用了天然膜中的RyR蛋白，我们提出RyR以RyR-调节蛋白复合体的形式工作。我们以RyR-junctin为模型对RyR1的工作机制进行了研究，发现.1..钙离子单独即可激活RyR-junctin复合体的RyR1通道；.2..钙离子与ATP共同可完全激活RyR-junctin复合体的RyR1通道；.3..Junctin通过与RyR1的跨膜区作用调节RyR1通道门控；.4..Junctin通过控制RyR1的S4-S5 linker而控制RyR1的S6，从而控制RyR1的门控。.综合文献的工作和我们的工作，我们提出了新的RyR1门控机制。我们的工作解决了RyR研究领域悬而未决的重要问题，揭示了调节蛋白junctin在RyR通道门控中的关键作用。