透明颤菌血红蛋白对毕氏酵母细胞的氧摄取促进作用及机理

巴斯德毕赤酵母表达系统具有高表达、高稳定、高分泌、适度糖基化等优点,已成为外源蛋白高效表达的重要体系之一。但巴斯德毕赤酵母高密度发酵对氧的需求量较大，使其在大规模发酵中通氧设备要求高、能耗大，从而限制了外源蛋白高效表达和工业化生产。透明颤菌血红蛋白VHb在毕赤酵母中表达，可调控细胞对氧的摄取，促进细胞生长和提高外源蛋白的表达。本课题在前期研究基础上，拟进一步构建不同类型（AOX1,GAP,YPT2,PsADH2启动子调控）的VHb毕赤酵母工程菌，采用RNA测序、DNA微阵列和荧光蛋白标记等技术，分析不同调控模式下VHb在毕赤酵母发酵过程中的表达及其毕赤酵母细胞全基因组表达，研究VHb对毕赤酵母细胞的氧摄取、细胞生长和外源蛋白表达的影响规律，探讨VHb对毕赤酵母细胞的氧摄取和外源蛋白表达促进的机理，为解决毕赤酵母高密度发酵摄氧不足的问题，及外源蛋白高效表达条件的优化与控制提供理论依据。

本项目将透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla Hemoglobin, VHb)在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达，可以改善高密度发酵过程中溶氧水平对外源脂肪酶的限制，提高了南极加丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B, CALB)的表达量。由于VHb自身的表达量和在细胞内亚细胞定位可能会影响其促进CALB表达的作用，本项目还对表达VHb的启动子进行了筛选，在这个过程中，意外地发现了一个新的组成型启动子PGCW14，虽然这一启动子对VHb的作用不明显，但可以用作其它外源蛋白的高效表达。通过启动子PYPT1介导将VHb在过氧化物酶体表面和基质上定位，可使CALB的表达量分别提高27.6%和20.5%，而在细胞质表达VHb，则可以使CALB的表达量提高60-80%。为了分析VHb促进CALB表达量提高的分子机制，本项目提取了细胞质内表达VHb的CALB分泌表达重组菌(PAOX1介导表达)发酵过程中的总RNA，通过RNA测序进行表达谱分析，并与未表达VHb的重组菌进行比较，发现了在电子传递链和三羧酸循环等与呼吸和能量代谢有关的途径中许多基因表达下调，表明VHb的表达可能通过呼吸和能量代谢途径影响脂肪酶的表达，详细的分子机制有待进一步的研究。