利用透明颤菌血红蛋白基因开展托品烷生物碱次生代谢工程的研究

High oxygen dissociation rate constant of Vitreoscilla hemoglobin (VHb) reflects the VHb rapid release combination of oxygen, oxygen transfer through accelerating the host body to promote the growth of the host under hypoxic conditions, protein and metabolic synthesis.So it is widely used in metabolic engineering of microorganisms and plants. The VHb regulation of the metabolic network is also subject to the intracellular distribution of the enzyme, composition factors, and VHb positioning may lead to different phenotypic effects in different subcellular structures (such as cytoplasm, chloroplasts and mitochondria). Belladonna alkaloids are a class of plant secondary metabolites with important medicinal value. The final biosynthesis step of scopolamine (main medicinal ingredient) requires oxygen participation. Oxygen transmission bottleneck restricting the plant cells to synthesize useful alkaloids in Belladonna hairy root mass culture process. In this study, we intend to clone VHb coding genes to build Belladonna hairy root strain transformed by different subcellular positioning expression vector; green fluorescent protein (GFP) track VHb intracellular activity process; correlation analysis of VHb and scopolamine biological synthesis;in-depth analysis mechanism of VHb at the cellular level; to solve the problem of oxygen in the large-scale hairy root cultivation.

透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)极高的氧解离速率常数反映VHb能迅速释放结合的氧，通过加速宿主体内的氧传递来促进宿主在缺氧条件下的生长，提高其蛋白质和代谢物的合成，被广泛应用于微生物和植物代谢工程。VHb对代谢网络的调节同样受到细胞内酶的分布、组成等因素的影响，因此VHb定位于不同亚细胞结构（如细胞质，叶绿体，线粒体）可能会导致不同的表型效应。莨菪生物碱是一类具有重要药用价值的植物次生代谢产物。主要药用成分东莨菪碱的生物合成的最后一步需要氧气的参与。莨菪毛状根大规模培养过程中氧传输成为制约植物细胞合成有用生物碱的瓶颈。本研究拟克隆VHb编码基因并构建植物不同亚细胞定位表达载体转化莨菪发根，利用绿色荧光蛋白(GFP)追踪VHb在细胞内的活动过程，定量VHb与东莨菪碱生物合成的相关性，深入分析VHb在细胞水平作用机制，解决毛状根大规模培养供氧不足问题。

透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)极高的氧解离速率常数反映 VHb 能迅速释放结合的氧，通过加速宿主体内的氧传递来促进宿主在缺氧条件下的生长，提高其蛋白质和代谢物的合成，被广泛应用于微生物和植物代谢工程。莨菪生物碱是一类具有重要药用价值的植物次生代谢产物，其生物合成的最后一步需要氧气的参与。莨菪毛状根大规模培养过程中氧传输成为制约植物细胞合成有用生物碱的瓶颈。本项目通过克隆 VHb编码基因并构建“定位序列-外源基因-融合 tag”通用耦联载体转化莨菪发根。通过引导原核生物 vhb 基因进入线粒体和叶绿体特异表达，促进转基因毛状根在液体培养基中扩大培养的时候氧的传递和供给，莨菪生物碱合成水平及关键酶PMT 和 H6H基因与野生型对照相比有显著提高；解决了缺氧的问题，增强次生代谢产物的合成，提出了一种从能量供给入手调控代谢途径的思路，为利用原核生物基因开展高等植物莨菪生物碱的次生代谢工程提供一种新的有效策略。