季也蒙毕氏酵母菌菊糖酶合成和调控的研究

菊糖酶在食品、医药、发酵工业和生物燃料酒精生产等方面具有重要的用途，最近几年我们在酵母菌菊糖酶生物合成、物理化学特性、基因克隆表达和潜在应用等方面取得了重要进展。但是该酶合成在季也蒙毕氏酵母中受到葡萄糖的严重阻遏作用。该申请项目就是要研究不同葡萄糖浓度对该酵母菊糖酶合成和菊糖酶基因表达的影响；研究Snf1和Mig1这两种蛋白质在该酵母菊糖酶葡萄糖阻遏和葡萄糖解阻遏中的作用；研究该酵母基因敲除载体和高效表达载体的构建和应用。以便了解季也蒙毕氏酵母菊糖酶葡萄糖阻遏和解阻遏机理，以便将来在信号传导水平上弄清葡萄糖与菊糖酶葡萄糖阻遏和葡萄糖解阻遏之间的相互关系，同时可以进一步提高季也蒙毕氏酵母的菊糖酶产量，使该酵母菊糖酶得到更广泛的应用

首先研究了产菊粉酶酵母季也蒙毕氏酵母葡萄糖解阻遏与菊粉酶合成的关系，发现通过基因突变导致MIG1基因突变和Mig1蛋白质氨基酸发生变化，结果突变菌株的菊粉酶合成得到了葡萄糖解阻遏，菊粉酶产量明显增加。本研究通过基因敲除法阻断K. marxianus km菌株MIG1基因，获得的敲除菌株 km-15菌株葡萄糖阻遏作用得到解除。与野生型菌株km的相比，敲除菌株km-15的乳糖酶、菊粉酶和β-葡萄糖苷酶的产量均有很大提高，同时编码这些酶基因的表达量也有极大提高。说明K. marxianus km中的Mig1确实能阻遏某些基因的表达，对一些酶的合成具有调控作用。从扣囊复膜酵母A11菌株的基因组DNA中克隆到的MIG1基因全长1152 bp，编码384个氨基酸的蛋白质，有高度保守的两个锌指结构，Mig1蛋白还有一个短的保守基序，可在葡萄糖阻遏中起重要作用。然后敲除扣囊复膜酵母A11菌株的MIG1基因，获得的敲除菌株A11-c葡萄糖阻遏得到了解除。与菌株A11相比，敲除菌株A11-c淀粉酶、酸性蛋白酶和β-葡糖苷酶产量及其基因表达量有很大提高。说明扣囊复膜酵母中的Mig1确实能阻遏某些基因的转录，它对一些基因的表达和一些胞外酶的合成起调控作用。 敲除了高产油脂Y. lipolytica ACA-DC 50109的MIG1基因。敲除菌株细胞中的油滴数目明显比野生型菌株的高，同时敲除菌株M25细胞油脂含量和脂类合成的有关基因表达量明显比野生型菌株的高。但是与脂类降解有关的基因之一表达量下降，所以敲除菌株M25细胞的油脂合成得到了明显提高。从K. marxianus km菌株基因组DNA中克隆了转录激活蛋白基因LAC9p1，该基因含有2700 bp，编码含有900个氨基酸的蛋白质，该蛋白质除了具有除了具有高度保守的锌指结构外，在乳糖存在情况下还能形成二聚体。然后敲除了K. marxianus km菌株中转录激活蛋白基因LAC9p1。当把获得的敲除菌株 KM-HPT培养在乳糖、半乳糖和葡萄糖混合物以及半乳糖中，乳糖酶合成及其基因的表达量明显下降。同时发现LAC9p1基因本身的表达也受到葡萄糖的阻遏，但受到乳糖和半乳糖的诱导。