日本脑炎病毒E蛋白上一个重要构象性中和表位的确定及其在病毒感染细胞中的作用

中和表位分析是研究病毒感染宿主细胞机制的基础。日本脑炎病毒（JEV）糖蛋白E被认为是介导病毒入胞的受体结合区，以往研究也表明JEV中和表位多在E蛋白第Ⅲ结构域内。申请者独家拥有两株生物学功能不同但均具有高中和活性的抗JEV E蛋白单克隆抗体，相加实验结果显示两者识别的表位非常接近，但不是Ⅲ区内的线性表位。因此，我们认为其极可能是涉及整个E蛋白的构象性中和表位，对JEV感染细胞有重要影响。为了确定这一表位，本课题拟利用单抗可变区基因序列进行计算机同源建模，获得空间结构模型后与已有的JEV E蛋白空间结构模型进行计算机模拟的分子对接，确定E蛋白上与单抗结合的表位。再以JEV感染性克隆为模板，对表位中的关键氨基酸进行定点突变，构建表位突变JEV变异株，观察变异病毒株感染易感细胞能力的变化，证实该表位在感染细胞中的作用，为阐明单抗中和作用机制及该表位在JEV感染细胞中的生物学功能提供关键实验依据。

日本脑炎是由日本脑炎病毒（JEV）引起的急性中枢神经系统感染，主要发生于10岁以下儿童，流行于我国广大地区，临床以高热、惊厥、意识障碍及脑膜刺激征为主，病死率可达10%，幸存者留有各种神经系统后遗症，威胁人民生命与健康。.JEV 是黄病毒属成员，包膜糖蛋白E是主要结构蛋白之一，从N→C端分为I、II、III三个功能结构域，以往国内外研究也表明E蛋白上的中和表位多在Ⅲ区内。本课题组拥有2株功能独特的抗JEV E 蛋白单克隆抗体（2H4和2F2），均具有极高的病毒中和活性，但其识别表位却不局限在传统上认为的III区：因为单抗不与III区发生结合，但能与全长E蛋白结合。ELISA相加实验显示这2株单抗的相加指数很低（约20%），提示它们所识别的位点相同或大部分重叠。故我们认为这2株单抗识别的并非III区线性表位，极可能是一个涉及整个E蛋白构成的构象性中和表位。为验证这一假说，我们设计了本课题研究，期望通过获得2株单抗可变区基因，构建单抗可变区空间模型，以抗原-抗体三维结构为依据，采用计算机模拟的分子对接方法，对E蛋白与2H4和2F2的结合进行模拟对接，了解E蛋白上与这2株单抗结合的关键氨基酸表位，并利用结合实验，验证不同E蛋白片段与2株单抗的结合，从而明确该表位的生物学功能。.通过RT-PCR方法，分别获得了2H4、2F2单抗轻链和重链可变区基因，符合鼠源性IgG亚类、κ型，其原核表达的重链表达产物具有结合JEV的能力。完成了2H4、2F2的轻链、重链可变区基因的3D建模以及优化，实现了与JEV E蛋白的模拟分子对接，结果显示：E蛋白与2H4、2F2的结合位点分别有5、9个，均位于E蛋白的I区和III区功能域，其中I区16Ser和37Asp为2株单抗共同识别的位点，III区则集中在353-388区域，其中2F2识别的300Thr未见有相关报道。分别表达了E蛋白膜外区以及I、III区截短体，行蛋白印渍实验，结果显示：还原条件下各片段均不与单抗与兔抗JEV多抗反应，非还原条件下E蛋白全长以及I区可以和单抗、多抗反应，单独III区片段不与单抗反应而能与多抗反应。.综上，2株单抗识别的是构象性表位，其结合至少需要完整的I区功能域，且不依赖于III区功能域片段的存在。换言之，I区功能域对于实现单抗的结合活性而言不可缺少。此结论证实了我们的假说，深化了对2H4、2F2中和作用的认识。