基于高细胞密度的大肠杆菌动态调控新模式

Dynamic control of metabolic routes during fermentation could improve cell activity and maximize production and productivity. To realize the application of the metabolic dynamic control strategy in fermentation industry, this project will construct a high-cell-density depending metabolic dynamic control system in Escherichia coli. Firstly, we reengineer and construct a new quorum-sensing system which could sense higher cell mass density with low signal molecular accumulation. The obtained quorum-sensing system will be coupled with the toggle switch to construct a metabolic dynamic control system, and to incompatibly control the expression of two target genes (initiate one and block the other gene expression simultaneously) according to high cell density. Regulation effects of the metabolic dynamic control system will be studied and further applied in lactate fermentation to reveal the effects on coordinating the contradiction between cell growth and product fermentation. The metabolic dynamic control system could be applied in other industrial microorgnism, promote the development of metabolic engineering both theoretically and methodologically and improve fermentation production and process.

对发酵过程中代谢途径的表达进行动态控制，可使细胞以高活性合成目的代谢产物，最大化产量和生产效率。为实现代谢途径动态调控策略在发酵工业中的实际应用，本项目将构建依赖高细胞密度的大肠杆菌动态代谢调控系统。首先，对群体感应系统进行改造，构建可监测更高细胞密度且仅合成低浓度信号分子的新型群体感应系统；并将该群体感应系统与拨动开关偶联，组装成依赖高细胞密度的动态代谢调控系统，使其根据细胞自身密度不兼容式控制两个目标基因的表达（既起始一个基因表达的同时阻断另一个基因的表达）。进一步考察该动态调控系统控制代谢途径表达的性能，并将其应用于实际乳酸发酵过程，考察在协调细胞生长与产物合成之间矛盾的作用。所构建代谢途径的动态调控系统将对工业微生物菌种的改造具有普遍的适用意义，对代谢工程理论和方法的发展以及对发酵工业产量的提高和工艺的改进有促进作用。

构建能够监测自身细胞密度，并以此作为信号来调节目标代谢途径的动态代谢调控系统，对工业微生物菌种的改造具有普遍的适用意义。本研究构建了依赖较高细胞密度的大肠杆菌动态代谢调控系统，并成功协调了L-丙氨酸的发酵过程。.项目首先对群体感应系统进行改造，利用SLIC方法构建了新型群体感应系统Px-luxR-luxI-Plux-gfp。各系统能够感应的细胞密度不同，对细胞密度的响应强度也不同。质粒上表达或者染色体上整合有新型群体感应系统的重组菌株可在OD600值达到2以上时启动目标基因的表达，提高了群体感应系统启动目的基因表达时的细胞密度。所构建的可识别不同细胞密度的群体感应系统同样可应用于其他需求的发酵过程，对工业微生物菌种的改良具有普遍的适用意义。.将新型群体感应系统与拨动开关偶联，组装成依赖较高细胞密度的动态代谢调控系统，可不兼容式控制两个目标基因的表达（既起始一个基因表达的同时阻断另一个基因的表达）。PSlp和Plux引导的动态代谢调控系统在培养基中有微量乳糖存在时具有一定的应用潜力。该系统对发酵工业产量的提高和工艺的改进有一定的促进意义。.构建了基因开关控制型L-丙氨酸合成重组菌株E. coli B0016-060BC，分阶段实现了细胞的快速增量和L-丙氨酸的高强度合成，L-丙氨酸产量可达167 g/L，是目前报道的最高水平。.项目按照要求顺利完成，获得了较好的学术成果。项目执行期间发表标注有本基金项目的论文共7篇，其中SCI文章5篇，CSCD论文2篇，申请发明专利1项。培养博士研究生1人、硕士研究生6人。