须糖多孢菌丁烯基多杀菌素生物合成的调控网络及重要基因元件优化

Butenyl-spinosyns is important secondary metabolite containing lactone ring, which is basically an active macrolides and is produced by Saccharopolyspora pogona, and one of the most development prospect high-efficiency, broad spectrum and safety insecticide. Due to its synthetic quantity very low, study the butenyl-spinosyns biosynthesis network, synthetic pathway and build good “chassis” have had important meaning. Based on this strain whole genome sequencing and quantitative proteomic analysis, proceed transcriptome sequencing and analysis, combined with bioinformatics technology, this project study the interconnected of butenyl-spinosyns function genome, transcriptome and proteome, analytic its biosynthesis control network. Then, conduct butenyl-spinosyns biosynthesis pathway key control elements Succinate-semialdehyde dehydrogenase, Acyl-CoA dehydrogenase, TetR family transcriptional regulator, AraC family transcriptional regulator and Bacterioferritin modification, promoter replacement and metabolism regulation functional research according to the multi-omics data, revealing the control mechanism to butenyl-spinosyns biosynthesis. Through the above-mentioned important gene elements is optimized and combined with fermentation precursor adding and high-throughput screen, receiving the engineering strain for promote the effective biosynthetic of butenyl-spinosyns.

丁烯基多杀菌素是由须糖多孢菌生物合成的一种大环内酯结构的次级代谢产物，是国际上最具有发展前景的高效、广谱和安全杀虫剂。该菌丁烯基多杀菌素合成量极低，研究其生物合成调控网络、合成途经及其优良"底盘"细胞的构建，促进其高效生物合成，具有重要意义。本项目在前期完成该菌全基因组测序、定量蛋白质组分析的基础上，进行转录组测定和分析，结合生物信息学技术，研究丁烯基多杀菌素功能基因组、转录组和蛋白质组的相互关联，解析其生物合成代谢调控网络。根据对该菌三大组学分析，重点进行丁烯基多杀菌素合成代谢途经中的重要基因元件琥珀酸半醛脱氢酶、脂酰基-CoA脱氢酶、TetR调控因子、AraC调控因子和细菌铁蛋白进行重组修饰、启动子替换和代谢调控功能研究，揭示其在丁烯基多杀菌素生物合成的作用机制，并对上述重要基因元件进行优化，结合发酵添加前体物质和高通量筛选，获得促进丁烯基多杀菌素高效生物合成的工程菌。

丁烯基多杀菌素是由须糖多孢菌生物合成的一种大环内酯结构的次级代谢产物，是国际上最具有发展前景的绿色生物杀虫剂。该菌丁烯基多杀菌素合成量极低，研究其生物合成调控网络、合成途经及其优良"底盘"细胞的构建，促进其高效生物合成，具有重要意义。本项目在前期完成该菌全基因组测序、定量蛋白质组分析的基础上，进行转录组测定和分析，结合生物信息学技术，研究丁烯基多杀菌素功能基因组、转录组和蛋白质组的相互关联，解析其生物合成代谢调控网络，获得了重要进展。（1）在获得基因组和蛋白组数据基础上，对须糖多孢菌进行转录组学测序和代谢组分析，挖掘到与丁烯基多杀菌素生物合成具有强相关性的差异表达基因，鉴定到磷酸烯醇式丙酮酸在丁烯基多杀菌素合成期间呈现连续上升趋势。（2）在多组学分析的基础上，结合须糖多孢菌生长曲线和丁烯基多杀菌素合成累积曲线，挖掘须糖多孢菌生长过程中丁烯基多杀菌素开始累积期、快速累积期和稳定期的关键调控基因，解析须糖多孢菌生长状况、丁烯基多杀菌素的产生特定和代谢产物的变化规律，建立了基因-酶-代谢物（代谢反应）之间的关联，构建了丁烯基多杀菌素生物合成调控网络。（3）根据多组学分析和代谢网络挖掘，筛选到多个影响丁烯基多杀菌素生物合成的潜在调控因子和功能蛋白，经过遗传修饰和产量分析，证实细菌铁蛋白基因、TetR家族调控基因sp13026、sp1418和sp2584、多核苷酸磷酸化酶基因和琥珀酸半醛脱氢酶基因等是调控丁烯基多杀菌素生物合成的重要基因。（4）对须糖多孢菌功能基因组中的5个竞争性聚酮化合物基因簇进行敲除，发现4号基因簇敲除严重抑制了须糖多孢菌的生长发育，2个基因簇敲除引起了产量的下降，仅13号基因簇和14号基因簇的敲除，促进了丁烯基多杀菌素的生物合成，分别提高了6.42倍和4.06倍。对13号基因簇进行深度挖掘，找到了调控丁烯基多杀菌素生物合成的关键因子Sp1764,构建了一株优势底盘菌株。（5）对须糖多孢菌合成发酵培养基配方进行碳源优化研究，在所使用的葡萄糖等11种碳源中，筛选出甘露糖可作为取代葡萄糖的最佳碳源，并确定其在合成发酵培养基配方中的最适添加浓度5 g/L。与初始合成发酵培养基相比，优化后合成发酵培养基配方能显著促进野生型须糖多孢菌及其工程菌株生长以及丁烯基多杀菌素生物合成，说明优化后的合成发酵培养基配方具有普遍适用性。