基于均相靶识别诱导原位转录扩增的超灵敏生物传感新方法及其应用研究

Ultrasensitive detections of nucleic acids and proteins play crucial roles in life science research and early diagnosis of diseases. The present biosensing technologies mostly need surface immobilization of affinity ligands and Heterogeneous binding of targets, which affect the sensitivity and the reproducibility of the analytical methods, and limit their applications in the ultrasensitive bioanalysis. .In this project, a series of new multipurpose molecule probes will be designed, and the principle of their target- recognition and binding-mediated sterical conformation will be studied. By combining RNA in vitro transcription with DNA isothermal amplification, biofunctionalized nanoparticle probes, protein recombination and bio-barcode techniques, several original cascade signal transformation and amplification strategies will be proposed. Furthermore, these strategies will incorporate with electrochemical and chemiluminescence biosensing arrays for exploring new synergistic mechanisms of homogeneous and heterogeneous reaction procedures. Thus, high specificity and high affinity of the homogeneous target binding, significant performance of the signal transformation and amplification, and signal readout and spatial discrimination of the array can be integrated in the same biosensing system naturally. A series of novel ultrasensitive and multiple biosensing technologies can be developed for detections of nucleic acids and proteins and analysis of their interactions..The proposed biosensing technologies will become a powerful tool for investigating the roles of the low abundance nucleic acids and proteins in biological and pathological processes, and clinical early diagnostics. This primary research will open new horizons for integrating different disciplines and will promote the research of analytical chemistry.

超灵敏的核酸和蛋白质检测对于生命科学研究和疾病早期快速诊断具有重要意义。现有生物传感技术大多采用靶向识别元件的固相组装和靶分子的异相结合，往往导致识别分子亲和力和均一性降低；影响传感器的灵敏度和重复性，不利于超灵敏检测及实用性。本项目拟通过设计一系列新颖的多功能复合分子探针；研究复杂基质环境下分子探针与靶分子均相识别结合及其所致的空间构象变化规律。利用核酸体外转录、核酸等温扩增、纳米探针、蛋白质重组、生物条码等技术，建立全新的基于核酸体外转录的联级信号转化放大策略。结合电化学、化学发光传感芯片，探索均相、固相表面多步协同反应机制。在同一传感体系有机整合均相的原位靶分子识别、信号转化放大；固相的信号检测、空间分辨。构建一系列超灵敏、多组分的核酸、蛋白标志物检测及相互作用分析新方法；发展高效简单实用的一体化生物分析技术。为筛选新的疾病标志物提供有力工具，为疾病的早期快速诊断提供新的技术支持。

本项目实施以来，以电化学、荧光、化学发光、比色等生物传感技术为平台，利用核酸体外转录、核酸等温扩增、多功能纳米探针等技术，建立了一系列超灵敏、多组分的核酸、蛋白标志物检测及相互作用分析的新方法。截止目前，已发表SCI论文29篇（通讯作及一作16篇），其中在影响因子5以上的杂志发表21篇。 主要研究内容包括：.（1）病原菌核酸的电化学生物传感检测.基于T7 RNA聚合酶和缺陷T型DNA结构介导体外转录的信号放大转化策略，开发了两种简单实用、超灵敏的病原菌核酸检测电化学传感技术，分别用于基因组DNA提取液中invA基因的直接检测和临床标本孕妇B族链球菌（GBS）核酸的检测，简单实用，有望成为临床POCT的一个潜在的工具。.（2）多组分miRNA的同时化学发光检测.构建了一种基于靶核酸诱导纳米结构变化的新型DNA纳米镊，可应用于逻辑门的构建以及无酶且高灵敏的多种miRNA的化学发光检测。.（3）循环体液稀有肿瘤细胞的比色检测.设计一条同时含有适体序列和滚换扩增反应（RCA）引物序列的适体-引物探针，实现了临床实际样本中稀有肿瘤细胞的超灵敏比色检测，在肿瘤的早期筛查与诊断中具有广阔的应用前景。.（4）细胞表面蛋白状态的原位成像.基于DNAzyme催化的酪胺沉积反应(DCTDR) 和共定位触发的DNA纳米自组装分别用于膜蛋白HER2状态的原位放大成像。两种方法实现了HER2单体及其二聚体的原位成像和定量分析，为疾病诊断和靶向药物治疗的膜蛋白研究提供了新的视角。.（5）蛋白质生物标志物的高灵敏免疫检测.整合界面上高特异性免疫识别优势与均相的高效体外转录效率，建立了一种界面识别诱导的均相指数转录扩增策略用于VEGF的检测，同时实现了实际样本中VEGF的定量分析，更有利于辅助临床相关疾病的诊断与治疗。.（6）MicroRNA的超灵敏传感检测.本研究整合QDs表面靶向诱导的DNA纳米自组装和DNA酶介导的双重淬灭机制建立了简单超灵敏检测靶核酸的荧光生物传感器，对实际样本的检测也具有很好的检测性能，在疾病的分子诊断中具有巨大的潜力。