膜蛋白酶介导的多黏菌素耐药机制研究

Colistin has been regarded as the last resort antibiotic to combat multidrug resistant by Gram negative bacteria. But recent studies showed that the emergence and dissemination of plasmid-mediated colistin resistance enzyme MCR-1 could lead to colistin resistance. Here, we are aiming to investigat the structure and catalytic mechanisms of embedded enzyme MCR-1. Firstly, we executed the crystallization with high pure proteins and keep improving the diffraction of crystal. We then characterized the modification of lipid A extracted from E. coli BL21 by MCR-1 via mass spectrometry to reveal the catalytic mechanisms of MCR-1. Lastly, our findings will elucidate the interaction between colistin and MCR-1 using confocal laser scanning microscopy. Meanwhile, we are screening the putative inhibitors for Mcr-1 based on colistin susceptibility test. Overall, our studies will establish a basis for designing MCR-1 inhibitors and provide an alternative mechanism for MCR-1.

多粘菌素被认为是治疗革兰阴性菌感染后最后选择的抗生素。近期研究表明，质粒介导的mcr-1基因可致多黏菌素耐药，并在动物和人之间广泛传播, 但Mcr-1具体如何导致多黏菌素耐药的分子机制尚不清楚。因此，解析MCR-1蛋白结构及揭示其生物学功能迫在眉睫。本课题组利用不同表达载体和表达系统对MCR-1膜蛋白进行研究，不断改进纯化和结晶条件，以获得高分辨率蛋白结构。同时结合体外活性实验、质谱定性、定量分析MCR-1对大肠杆菌lipiA的影响，进一步阐明MCR-1的生物学功能；我们利用荧光标记多粘菌素E和MCR-1，借助共聚焦激光扫描显微术观察多粘菌素E与大肠杆菌的相互作用，为揭示MCR-1致多粘菌素耐药机制提供新的选择途径。并通过多粘菌素的药敏试验，从化合物筛选库筛选出能阻断MCR-1介导的多粘菌素耐药的小分子。进一步阐明其逆转多黏菌素耐药的分子机制，为研发新药、延缓多黏菌素耐药奠定重要基础。

革兰氏阴性菌通过修饰其外膜脂多糖（LPS）来抵御多粘菌素的毒性。这种修饰主要是通过添加阳离子分子如磷酸乙醇胺（PEA）而发生。EcEptC是一种来自大肠杆菌的PEA转移酶。然而，与其同源物CjEptC（空肠弯曲杆菌）和MCR-1不同，EcEptC在大肠杆菌中过表达时不能介导多粘菌素抗性。在本研究中，我们报道了EcEptC C端推定催化结构域（EcEptCΔN）apo及与Zn2+结合状态下分辨率分别为2.10 Å和2.60 Å的晶体结构。EcEptCΔN排列成α-β-α折叠，并以保守方式携带锌离子。结合等温滴定量热法（ITC）数据，我们提供了对EcEptC识别Zn2+的机制的见解。此外，结构比较分析表明，在EcEptCΔN中缺乏在多粘菌素抗性中起关键作用的二硫键。在结构和生化证据的支持下，我们揭示了在PEA转移酶介导的多粘菌素抗性中二硫键的机制意义。重要的是，由于EcEptC中没有二硫键的结构效应，因此该蛋白不可能参与大肠杆菌中的多粘菌素抗性。此外，我们也对微生物耐药相关课题研究进行探索，并取得进展。在该项目支持下，共发表11篇研究/综述论文，培养了1名博士后，7 名博士研究生，7名硕士研究生。