干扰抗肝纤维化上游靶点TGF-β1和下游靶点TIMP后PDGF代偿功能的研究

In the previous subject,we interfered with the upstream target of liver fibrosis which was TGF-β 1 and the downstream targets TIMP-1, TIMP-2. The results showed that, after interference the expression of TGF-β1, IL-4 and IL-13 decreased unconspicuous, but after interference the expression of TIMP-1 and TIMP-2, the expression of IL-4 and IL-13 were clearly decreased. Contacting with the pro-fibrotic characteristic of IL-4 and IL-13, we suppose compensatory mechanisms may exist in the body, when we blocked the upstream target TGF-β1, other pro- fibrosis signaling pathway activated. Therefore, we want to observe whether the liver fibrosis signal pathways as PDGF are compensatory increased after interference the expression of TGF-β and whether feedback regulation mechanisms of TGF-β1、PDGF are existing in the body after interference the expression of TIMP-1 and TIMP-2. The study is distinct innovative, is the deepening of our last study. We hope to obtain a more scientific results by deepening the point that interference the downstream targets is much better than upstream targets.

通过前一课题对干扰肝纤维化上游靶点TGF-β1及下游靶点TIMP-1、TIMP-2的研究发现，干扰TGF-β1后，IL-4及IL-13的表达明显增高，而干扰TIMP-1、TIMP-2后IL-4及IL-13却明显降低，结合IL-4及IL-13都有致肝纤维化信号通路PDGF及组分（JAK/STAT、ERK、PI-3K）增强的作用，使我们想到了干扰上游途径TGF-β1后，机体可能存在代偿机制，使其致肝纤维化信号通路活化。因此,本项目设想通过干扰上游靶点TGF-β1后，体内外研究PDGF及组分是否有代偿性增强；同时研究干扰下游靶点TIMP-1、TIMP-2后，机体是否存在TGF-β1、PDGF及组分的反馈调节机制（正或负反馈）。这是一个具有鲜明创新性的研究思路，是对前一课题提出的抗肝纤维化研究从下游靶点着手的观点的深入，即：干扰下游靶点优于干扰上游靶点的观点的进一步深化，希望得出一个更为科学的结果

肝硬化治疗药物几乎都是瞄准TGF-β1作为研究靶点，实验室效果好，但临床效果应用差，并且我们前期课题研究发现TGF-β1并不是理想的靶点。本项目进一步探讨肝纤维化上游靶点TGF-β1及下游靶点TIMP-1/2对肝纤维化的影响。主要研究内容是干扰上游TGF-β1及下游TIMP-1/2后，PDGF及信号通路组分变化。首先是构建了siRNA-TGF-β1及siRNA-TIMP-1/2真核表达质粒，采用四氯化碳致大鼠肝纤维化模型，尾静脉注射干扰质粒，并成功进行了抗肝纤维化实验。结果：1）体内实验发现TGF-β1及TIMP-1/2 siRNA组能明显下调PDGFβR的表达。各干扰组的Smad2、3、4表达量明显降低，对Smad7表达没有明显的影响，但体外分离的HSC的研究却发现，TIMP-1/2 siRNA对磷酸化Smad2、3、4、6的表达没有明显抑制作用。2）对细胞活化通路p-Erk1/2的表达有抑制作用，TIMP-1/2siRNA的作用比TGF-β1siRNA的更明显。3）TIMP-1/2siRNA促进了活化的肝星状细胞的凋亡。4）分离各处理组大鼠肝脏HSC，TGF-β1、TIMP-1/2的表达被明显的抑制。siRNATIMP-1/2组磷酸化的Erk1/2表达明显少于siRNATGF-β1组，这种抑制导致HSC不能被活化或者活化降低，而使其分泌胶原的能力下降。5）TGFβ1siRNA与TIMP1/2siRNA对Ras、JAK/STAT3、PI3K的表达没有明显的影响。.以上研究的初步发现是TGF-β1、TIMP-1/2 siRNA对肝纤维化的形成有明显的抑制作用，除已知的途径外，还通过Erk1/2通路影响HSC的活化及凋亡。干扰TGF-β1 和TIMP-1/2的表达后没有发现PDGF的代偿性增高，反而是PDGF表达的减少。但是我们却有一新的发现，即干扰TGF-β1后，TIMP-1/2的表达却有明显的的增强。为了更好的研究，对方案进行了适当的修改，重新构建了转染效率更高表达更稳定的目的基因慢病毒表达载体，筛选了稳定的表达株。通过对HSC-6的反复研究得到了2个发现，第一：干扰TGF-β1后TIMP-1/2的表达明显的的增强，第二：干扰TIMP-1/2后TGF-β1的表达明显低于正常细胞。这一研究结果提示：干扰掉TGF-β1后，胶原分泌受到了抑制，但同时由于TIMP-1/2