基于“蛋白结合毒素- AhR通路”探讨益气活血降浊法对“微血管荒废-肾间质纤维化”病理链的影响

Chronic kidney disease（ARAS-CKD） caused by atherosclerotic renal artery stenosis（ARAS） plays an important role in the process of end stage renal disease（ESRD）.‘Microvascular Waste-Renal Interstitial Fibrosis’ regulated by ‘Protein-bound toxins -AhR pathways’ induced by the following endothelial damage factors is the main mechanism. It has been identified that Yiqihuoxuejiangzhuo Formula can abate ‘Microvascular Waste-Renal Interstitial Fibrosis’，then delay the Process of ARAS-CKD，but the mechanism was remained to be solved. The study modeled ApoE（-/-） uninephrectomized mice and HMEC-1/HK-2 cells co-culture system. Added Chinese Medicine guided by Yiqihuoxuejiangzhuo Formula to intervent. Changes of ‘Protein-bound Toxins-AhR Pathway’, the following endothelial damage factors, Microvascular Waste and Renal Interstitial Fibrosis were measured under light microscopy, electron microscopy, RT-PCR、ELISA、western-Blot. In order to confirm the hypothesis in which Yiqihuoxuejiangzhuo Formula controls ‘Protein-bound toxins -AhR pathways’then abates ’Microvascular Waste-Renal Interstitial Fibrosis’ and delays the process of ARAS-CKD in the end. The study is going to interpret TCM pathogenesis and treatment, provide new thinking and new method in delaying the process of ARAS-CKD with TCM.

动脉粥样硬化性肾动脉狭窄引起的慢性肾脏病（ARAS-CKD）是终末期肾病的重要原因。“蛋白结合毒素-AhR通路”调控下游内皮损伤因子诱导“微血管荒废-肾间质纤维化”为其关键进展机制。我们既往已证实益气活血降浊法能减轻“微血管荒废-肾间质纤维化”延缓ARAS-CKD进展，但作用机制欠清。本课题拟用ApoE（-/-）小鼠单肾切除ARAS-CKD模型及HMEC-1/HK-2细胞共培养系统，给予益气活血降浊中药干预，并采用光镜、电镜、RT-PCR、ELISA、western-Blot等方法，观察“蛋白结合毒素-AhR”及下游内皮损伤因子变化，微血管荒废、肾间质纤维化情况，以期证实“益气活血降浊法”通过调控“蛋白结合毒素-AhR通路”，减轻“微血管荒废-肾间质纤维化”延缓ARAS-CKD进展的假说，阐释ARAS-CKD中医治法的靶点和机制，为中医药延缓ARAS-CKD进展提供新的思路和科学基础。

由动脉粥样硬化性肾动脉狭窄（Atherosclerotic renal artery stenosis，ARAS）引起的肾脏病，是引起终末期肾脏病的主要原因。随着肾灌注的下降，肾组织内“微血管荒废—小管间质纤维化”的病理链逐渐形成，而蛋白结合毒素诱导AhR通路激活后，引起的血管内皮损伤可能是该病理链进展的主要原因。既往本团队已发现具有益气活血降浊解毒作用的中药可改善ARAS小鼠肾间质纤维化程度，本研究调整动物模型为ApoE-/-小鼠高脂饲料喂养联合5/6肾切除进行在体实验，选用低、中、高剂量益肾缓衰方（Yi Shen Huan Shuai Recipe，YSHSR）灌胃，灌胃18周后观察疗效。同时，通过体外培养人脐静脉内皮细胞（HUECs）和人近端肾小管上皮细胞（HK-2），建立蛋白结合毒素硫酸吲哚酚（IS）刺激下的毒素模型，观察YSHSR含药血清对IS诱导下血管内皮损伤的保护作用以及对AhR/NOX4通路的影响，并通过共培养体系，进一步明确YSHSR通过保护血管内皮细胞，从而改善HK-2细胞的表型转化的机制。结果发现，YSHSR可明显改善ARAS小鼠肾功能、肾动脉和肾组织的病理形态学变化，降低小鼠血清蛋白结合毒素（IS、硫酸对甲酚）水平，改善小管间质纤维化相关指标（Collagen IV、a-SMA、TGF-β1）表达以及血管内皮损伤指标（ADMA、vWF）的水平，同时对介导蛋白结合毒素转运的阴离子转运蛋白(OAT)、IS激活的芳香烃受体（AhR）以及下游的氧化应激（NOX4、SOD、MDA）和炎症反应（MCP-1）具有一定的负向调节作用，其中以低剂量组效果最稳定。此外，YSHSR含药血清可明显改善IS刺激下HUVECs和HK-2细胞活力的损伤，改善IS刺激下HUVECs的细胞增殖活力、衰老、氧化应激、AhR/NOX4通路相关分子基因和蛋白的变化，从而进一步改善HK-2细胞增值活力和纤维化表型相关指标（CollagenIV、a-SMA、TGF-β1）的表达。结果提示， YSHSR可通过保护血管内皮进一步改善小管间质纤维化，而其中机制可能与该方下调蛋白结合毒素诱导血管内皮的AhR/NOX4通路激活及其下游氧化应激有关。