山羊早期卵泡和克隆胚胎发育中抗氧化机制的研究

ROS(Reactive oxygen species) exists in follicular fluid and embryo culture media. ROS plays an important role in oocytes and embryos development in a certain level, however, high levels of ROS can cause oocytes meiosis stagnation, degradation, and apoptosis, which has a harmful effect on oocyte maturation and subsequent embryo development. In addition, studies on regulation mechanism of antioxidant stress during goat follicle growth and embryo development have not been reported yet. Antioxidation of NRF-1 and PGC-1α, mitochondria specific transcripts, are investigated in this study, using immunohistochemistry, western-blot, protein phosphorylation, gene over-expression or RNA interference, and Raman microspectroscopy methods. The aim of this study is to have a comprehensive understanding of goat reproductive biology and try to reduce oxidative damage and death during oocytes growth and cloned embryos development. This research plays a key role in improving quality of in vitro embryo and efficiency of transgenic cloned animals.Tne study also enrich theory of embryo development biology.

卵泡液和胚胎培养液中存在活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)，一定水平的ROS对维持卵母细胞和胚胎的正常生长发育发挥着重要作用，而高浓度的ROS则能引起卵母细胞减数分裂停滞和降解，继而发生凋亡，对卵母细胞成熟和后期胚胎发育造成不良影响。然而，山羊卵泡生长发育和胚胎体外培养过程中的抗氧化应激机制至今还未见报道。本项目利用免疫组织化学、蛋白印迹和磷酸化、基因干扰和过表达和显微拉曼光谱等方法研究线粒体特异性转录因子NRF-1和PGC-1α对山羊卵泡及胚胎早期发育过程中的抗氧化作用机制，分析氧化应激前后胚胎的生物学信息，探讨影响胚胎体外发育的原因，从而优化体外培养系。本项目的研究成果不仅对于改善动物胚胎体外发育的质量和提高转基因动物生产效率具有重要意义，而且可以丰富动物胚胎发育生物学的相关理论。

线粒体在动物卵泡发育、卵子成熟及其后续胚胎发育的过程中起着重要作用。线粒体转录相关因子NRF-1和PGC-1α能协同促进线粒体增殖，对调控线粒体的功能和抵抗氧化损伤有重要的作用，然而关于其调控卵泡发育与闭锁、卵母细胞成熟以及体外胚胎发育的研究还比较少。本试验以山羊卵巢卵泡与山羊及兔胚胎为对象，通过免疫组化和TUNEL共定位、Western-blot、过表达与干扰载体构建、免疫荧光、转染细胞等方法系统研究了NRF-1和PGC-1α在卵巢卵泡发育与闭锁、卵母细胞成熟和胚胎发育过程中的作用及其调控机制，并通过气相色谱-质谱联用技术检测胚胎的代谢谱，旨在探寻能预测胚胎发育潜能的特异性标记物。结果发现：（1）原始卵泡形成主要是在胎90至120日龄，而原始卵泡向初级卵泡的转换主要是在胎120日龄至新生1日龄；（2）在卵巢卵泡发育过程中，NRF-1和PGC-1α的表达异常，可能改变了线粒体的结构和功能，扰乱了氧化还原平衡，从而诱导颗粒细胞凋亡，导致卵泡闭锁；（3）氧化应激会导致卵母细胞体外成熟率下降，并影响胚胎的发育潜能，NRF-1和PGC-1α可能通过影响卵母细胞和胚胎的代谢水平而参与抗氧化损伤的调节；（4）不同质量胚胎的代谢液中含有多种显著差异代谢物，这些代谢物多参与碳水化合物、脂肪酸和氨基酸的代谢过程，与胚胎的体外发育潜能密切相关；（5）NRF-1和PGC-1α的表达水平可作为评价胚胎发育潜能的重要参考指标之一。本项目已正式发表SCI论文11篇、中文核心论文1篇，培养博士研究生4名，完成了各项任务指标。研究成果不仅丰富了山羊生殖生理学的理论研究，而且对于改善动物胚胎体外发育的培养体系、预测胚胎发育潜能具有重要意义，特别是结合不同质量胚胎体外发育的代谢差异物和线粒体相关基因的表达水平，筛选出了与胚胎体外发育潜能密切相关的代谢和分子标记物，对于提高转基因克隆动物生产效率具有较高的理论参考价值。