TRIM28对克隆绵羊早期胚胎印记基因甲基化的作用研究

Due to incomplete genomic reprogramming and partial gene aberrant methylation, the somatic cell nuclear transfer(SCNT) embryos have many problems during development. For example as abortion, stillbirth and Large offspring syndrome(LOS） et al. Which limitied the application of SCNT technolog in animal husbandry. During pre implantation early embryonic development, Trim28 plays an important role in imprinted gene methylation’s maintenance. The lack of maternal Trim28 is lethal to the normal fertilized embryos, and during the development process the embryos have the same syndroms like the abnormal fetuses of SCNT. Therefore, it is inferred that trim28 also play an important role in SCNT embryos’ genomic methylation. But it is necessary to remove the oocyte’s nuclear during the SCNT, so it is inevitably lost nuclear protein trim28 during the process. This study will use real-time quantitative PCR technology and immunocytochemical method and sulfuric acid hydrogen salt methylation detection method. We will detect trim28 expression in matured oocytes after nuclear remove and imprinted genes methylation change in cloned embryos. We want to reveal Trim28 gene’s function in cloned embryo development process. Then we will supply the TRIM28 which is expressed by somatic cells to make up the loss of maternal trim28 protein in SCNT embryos. And the purpose of this study is to provide an access to improve SCNT animal’ success rate.

体细胞克隆动物因基因组重编程不完全，部分基因甲基化异常导致流产、死胎和巨婴症等诸多问题，限制了其在畜牧业方面的应用。TRIM28在植入前早期胚胎发育过程中对印记基因甲基化的维持起着重要作用，母源Trim28缺失可导致正常受精胚胎死亡，其发育过程中具有与克隆异常胎儿相同的症状，因此推测TRIM28对于克隆胚胎的基因组甲基化修饰具有同样重要的作用，而克隆时的卵母细胞去核操作是必需的，这必然会丢失核蛋白TRIM28。本项目利用实时定量PCR方法、免疫细胞化学方法和过硫酸氢盐甲基化位点检测法以检测去核操作对成熟卵母细胞中TRIM28表达量的影响，以及克隆胚胎印记基因甲基化的变化，揭示克隆胚胎发育过程中Trim28基因的功能，最终通过体细胞表达TRIM28补充克隆胚胎丢失的母源TRIM28蛋白，并为提高克隆动物的成功率提供借鉴。

本研究首先克隆获得了绵羊Trim28基因的CDS序列，成功构建了能够在绵羊成纤维细胞中正确高效表达TRIM28的真核表达载体。另外，我们针对Trim28基因不同靶点设计多对siRNA，电转染绵羊成纤维细胞后，采用qRT-PCR和Western blot检测敲减效率，筛选得到能够有效抑制Trim28表达的siRNA。对绵羊胎儿成纤维细胞Trim28进行敲减后，印记基因簇Igf2-H19和Dlk1-Gtl2表达量发生变化，但是Igf2-H19的甲基化与对照组无差异，Dlk1-Gtl2的调控区IG-DMR甲基化水平出现显著的降低。研究表明Trim28在绵羊成纤维细胞增殖过程中对IG-DMR甲基化的维持起到重要作用。同时我们对其他印记基因表达也进行了检测，发现敲减Trim28后Peg3表达显著降低。而PEG3能够结合到H19 ICR区域抑制Igf2和H19的表达，推测Trim28敲减后导致PEG3表达下降很可能是Trim28调控Igf2-H19印记基因位点的方式。. 体细胞克隆过程中卵母细胞去核时随针移除细胞核和周围胞质中的母源核蛋白TRIM28及其它母源因子, 可能是影响绵羊克隆重构胚胎早期发育甲基化异常和克隆效率低下的重要原因之一。试验发现以转染TRIM28表达载体的成纤维细胞作为克隆供体细胞能够提高绵羊2-4细胞和8-16细胞时期克隆胚胎中Trim28表达量。且单细胞全基因组甲基化测序结果表明：正常克隆与转TRIM28克隆在囊胚期的差异甲基化位点与体内囊胚比较，转TRIM28组的这些位点甲基化水平更接近体内囊胚。. 本研究有望提高克隆胚胎的成功率，为克隆技术在生产中应用提供了可能。