miRNA对IGF2的表达调控在克隆绵羊肾脏和胎盘发育缺陷中的作用

肾脏和胎盘发育异常是克隆动物死亡的主要原因；印记基因表达异常会导致克隆动物肾脏和胎盘发生发育缺陷，而IGF2是调节胎盘和肾脏发育的重要印记基因；miRNA作为印记基因的重要调控子，是克隆动物印记基因研究的主要对象。本研究以新生死亡克隆绵羊肾脏和胎盘为研究对象，受精绵羊器官为对照，从mRNA和蛋白水平检测发育异常肾脏和胎盘中IGF2的表达情况，并通过Solexa测序和基因芯片技术筛选异常和正常器官中差异表达miRNA，通过miRNA与IGF2定量检测，以及与IGF2 3'UTR序列比对，确立目的miRNA，构建miRNA表达载体并转染于肝细胞中，从mRNA水平和蛋白水平检测肝细胞中IGF2的表达情况，筛选出对IGF2起调控作用的miRNA。通过本研究筛选出在克隆绵羊肾脏和胎盘中调控IGF2表达的miRNA，找到克隆绵羊肾脏和胎盘发育异常的理论依据，为提高克隆绵羊成功率提供理论基础。

由于部分克隆羊羔存在到期不产导致死胎、且部分死羔肾脏肥大的现象，分析可能与IGF2基因的异常表达有关。因此本课题以新生死亡克隆绵羊肾脏和胎盘为研究对象，正常绵羊器官为对照，分析其IGF2的表达情况，并筛选差异表达miRNA，确立对IGF2起作用的目的miRNA，并在细胞水平进行验证。通过本研究筛选出在克隆绵羊肾脏和胎盘中调控IGF2表达的miRNA，探明克隆绵羊肾脏和胎盘发育异常的原因，为提高克隆绵羊成功率提供借鉴。. 本课题从体细胞培养、卵母细胞处理、融合参数改进等方面对克隆绵羊的制作过程进行了优化；针对影响克隆效率的基因组印记调节基因Trim28，在绵羊上克隆了该基因，并构建了表达载体，用于提高克隆胚胎的效率。对新生死亡克隆羔羊解剖后，大部分羔羊其肾脏较大，胎盘未达到出生标准，对这2组器官的IGF2表达水平进行检测，以正常胎儿器官为对照，发现死亡克隆羔羊的IGF2 mRNA和蛋白表达水平均高于正常对照组；通过转录组分析发现，异常表达的miRNA有36个，通过文库筛选和文献分析初步将miR-483、miR-200、miR-141和miR-615作为靶标。构建miRNA表达载体，转染已有的HepG2细胞系，检测各miRNA的表达效果及对IGF2的作用。结果发现miR-483与IGF2呈正反馈，转入miR-483质粒的细胞，其IGF2的表达量也增加，当转入s-miR-483时，对应miR-483的表达量降低，IGF2的mRNA水平和蛋白水平同时降低。而miR-141与IGF2的表达水平呈负反馈。miR-615未发现与IGF2的表达呈现任何相关性。因此，本研究认为，miR-483过表达，促进IGF2的表达，而IGF2作为促进肾脏生长发育的重要生长因子，加大了克隆羊肾脏的生长程度；同时，由于miR-141表达水平下降，其对IGF2的抑制作用降低，而IGF2通过AKT信号通路使得胎盘发育持续呈较高水平，而胎盘通过持续分泌雌激素导致克隆羔羊未能如期生产，拖延时间过长导致黄染，这可能是导致克隆羊出生不久死亡的部分原因。. 通过本课题的实施，建立了绵羊肾脏和胎盘的miRNA表达库，找到了调控IGF2表达的miRNA，为后续研究提供了借鉴。